细胞培养室的建设与管理

汤加勇，赵 华，斯小东

(1.四川农业大学 动物营养研究所，四川 成都 611130；2.成都瑞智腾扬机电设备有限公司，四川 成都 611130)

细胞培养技术是当今生命科学各研究领域的基础技术和基本技能，也是细胞工程、基因工程和生物医学工程的重要研究手段。细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分。拥有好的细胞培养室，是保证实验研究顺利开展的基础条件之一，同时也能提高科研质量。对各科研高校及研究所来说，很多学科都根据自己科研需求建有细胞培养实验室，但其规模、级别、使用效率、管理模式等方面都缺乏统一的标准，普遍存在规模小，设计不合理，建设不规范，资金浪费，配套跟不上，缺乏有效的管理等诸多问题[1]。

四川农业大学是一所以生物科技为特色，农业科技为优势，多学科协调发展的国家“211工程”重点建设大学和国家一流学科建设高校，也是教育部本科教学工作水平评估优秀高校。四川农业大学动物营养研究所主要从事猪、禽、草食动物和水生动物的营养需要、营养代谢与调控、饲料营养价值评定、饲料加工配制技术，以及交叉领域如抗病营养、分子营养、营养与微生态学等的研究。随着学科发展和新实验室的规划，研究所于2014年着手在新校区(成都校区)设计、施工建设细胞培养室，并于2015年底正式投入使用，在使用过程中表现良好，但也出现了一些问题。本文就该细胞培养室的设计、建设、管理制度以及出现的问题等方面进行介绍，与广大同行进行探讨。

1 细胞培养室的设计与建设

细胞培养室是在原有普通实验室基础上改建而成，原实验室面积约140m2，基本属于梯形状。由于房间异型以及面积的限制，同时又考虑到研究所对无菌操作间数量的需求以及消防安全等方面要求，细胞培养室的最终平面设计图如图1所示[2-3]，且细胞培养区洁净度均达到十万级。该培养室共有无菌培养房6间，仪器室4间，缓冲更衣室1间，前处理消洗室1间，风淋室1间，不锈钢传递窗2个，缓冲洁净走廊1条。培养室内净高2.3m，隔断和天花板均采用手工玻镁中空彩钢板(阳角和阴角均采用圆角过渡)，地面采用医用PVC地胶。为了保证火灾发生时及紧急情况下室内人员的安全，特设计了两扇密闭全玻璃洁净门，紧急情况下可破门而出。其中一扇位于原实验室后门处(图1中右上角)，设置在房间内的目的是为多增加一个细胞培养间；另一扇位于风淋室旁缓冲洁净走廊尽头，此门只能在洁净区内打开，主要是确保风淋室系统出现故障关闭时，实验人员可通过此门离开房间。

图1 细胞培养室平面设计图

1.1 空调通风系统

本培养室采用净化回风加新风空调设备系统，空气经过初效、中效和高效空气过滤器三级过滤后送入室内[4]。初效和中效空气过滤器设置在空调机组内，高效空气过滤器设置在系统末端的高效送风口内。室外新风与室内回风混合经过空调机的初效过滤、冷却降温(加热升温)，经中效过滤和房间内的高效过滤风口送入净化房间。采用顶送风侧下回风的方式，送风量大于回风量，以保持室内正压。非洁净区域(缓冲/更衣间、前处理消洗室)共用一套通排风系统；净化区域独立设计一套净化空调系统，净化级别为十万级。

本培养室正好位于顶楼，为节省空间，将中央空调外机放置于楼顶。空调风机通过设置于送风主管道上的风量传感器和总送风电动阀对房间送风量进行精确控制。在每个培养间和仪器室设置独立回风系统，通过回风主管道上的电动比例积分阀控制房间回风总量，以保证洁净室内的压差；通过温湿度传感器对进入空调机组的冷热量进行调节，以保证房间的温湿度。新风管上装有比例电动开关风阀，并与对应的空调机组风机连锁，当风机关闭时，连锁关闭电动风阀。所有风阀均选用低泄漏风阀；所有仪器仪表在布局、管线开孔以及施工完成后都对孔隙进行密封处理。

1.2 电路系统

除空调设备单独走动力线外，房间内的电路系统均从缓冲更衣室内的UPS电源输出，以保证电压稳定和停电后的短暂供电，保护仪器设备的良好运行和断电后实验的及时处理。培养室内电线敷设均从玻美中空彩钢板内走线，保证无死角，利于卫生的打扫。照明灯具均采用不锈钢吸顶式洁净荧光灯，在缓冲走廊及门口均安装消防疏散指示灯。

1.3 气路系统(CO2管道)

CO2气瓶统一放在缓冲更衣室内更衣柜旁的气瓶柜内，通过316L不锈钢管道把气体输送到各个细胞培养房。钢瓶减压采用半自动切换系统。气路在主管道上设置自动切换系统，左右两瓶气体能自动切换保证不间断供气。管道与管道连接均采用轨道自动焊接方式，焊接时采用管内外充高纯氩气；阀门、减压器与管道连接采用不锈钢双卡套方式，方便拆卸。

1.4 自控系统

所有细胞间的温湿度、送回风量、室内压力、消毒时间等的设定，均通过缓冲更衣室门口的触摸控制屏来操作。该触摸屏采用密码登录方式，需要输入密码才能对参数进行设定，以方便管理。消毒系统采用臭氧密闭空间循环消毒[5]，臭氧发生器安装在风机口端，通过自控系统来设定消毒时间。消毒完成后消毒排风机启动，排出室内臭氧气体。

1.5 仪器设备的放置

考虑到研究所仪器设备的具体情况，本培养室设计了4个仪器操作间。仪器室1用于放置不同规格的离心机；仪器室2用于放置活细胞工作站(徕卡，DMI6000B)；仪器室3用于放置荧光倒置显微镜(徕卡，DMI4000B)；仪器室4用于放置常规的荧光倒置显微镜、细胞计数仪等常用设备。流式细胞仪(BD FACSVerse)由于不具有分选功能，同时为兼顾其他实验的需求，因此没有放置在培养室内。每个细胞间均放置至少一台二氧化碳培养箱、超净工作台(生物安全柜)、长宽高为1.5m×0.8m×0.8m的全304不锈钢台架以及用于放置常用耗材的收纳箱。在前处理消洗室放置了多台冰箱、水浴锅、生物安全柜、液氮罐等仪器设备。

2 细胞培养室的运行与管理

细胞培养室除需要好的硬件条件外，还需要有严格的管理制度。培养室的自控系统由专职教师负责管理[6-7]，系统每天7：00开放，20：00关闭，温度保持为22℃。培养室还制订了一系列相应的管理制度，主要包括细胞培养室使用制度、仪器设备使用制度、液氮罐使用及细胞冻存制度等[7-10]。

2.1 细胞培养室使用制度

1)每个进出细胞室的工作人员必须登记进出时间、使用细胞间号、使用仪器设备以及所做实验；

2)进入培养室，必须更换洁净的工作服和拖鞋；

3)进入细胞间操作完毕后，必须进行台面清洁，用过的器皿、杂物、废液等必须清理并带出培养室；

4)每周一次全面的卫生清理，包括地面、培养箱、桌面等，清理完毕后由专职老师负责臭氧消毒处理。

2.2 仪器设备使用制度

1)使用培养室内的任何仪器设备时，如出现故障需及时告知负责老师；

2)使用二氧化碳培养箱时，需每天观察二氧化碳压力表，如出现压力低需及时告知负责老师更换气瓶；

3)细胞放置在培养箱相应的划分区域，未经许可不许动他人放置的细胞；

4)拿取冰箱内样品时动作必须快，并及时关闭冰箱门；

5)活细胞工作站和荧光倒置显微镜必须在专责教师指导下进行操作；

6)二氧化碳培养箱的参数不能随意更改，如需更改则由负责教师进行。

2.3 液氮罐的使用及细胞冻存制度

1)由专责教师负责定期查看液氮的容量并订购，随时保证有一罐液氮备用；

2)存放细胞时要根据细胞种类放置，同时一定要在存放记录本上登记放入的位置、时间、细胞种类、数量、存放人等信息；

3)存取细胞时一定要注意安全，防止冻存管爆炸；

4)未经他人同意，请勿随意翻动他人细胞冻存样。

2.4 细胞培养技术的交流

细胞培养从技术本身来讲是一项通用的技术平台，但针对各个研究课题(方向)而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求各不相同，既有共性又有特殊性。本文的细胞培养室仅供研究所师生使用，因为涉及6个研究方向(家禽、水生动物、反刍、饲料、母猪和育肥猪)，所以细胞实验技术也大不相同。培养室针对这一情况建立了技术档案制度，由专人管理，不同方向的研究人员探索的新技术，如细胞基因的敲除、细胞基因的超表达、不同来源及类型的原代细胞分离培养及鉴定、细胞的免疫荧光分析等技术，不会因人走而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，从而为后来者提供更多的方便[10]。

2.5 收费制度

细胞培养室面积不大，但每年的维护成本却不低，主要来源于初、中、高效空气过滤膜的更换、二氧化碳的消耗、中央空调等仪器设备的维护和维修等。为了更好地运行和管理培养室，研究所制定了一套收费制度[11-12]。师生进入细胞间，需提前申请并领用相应培养间的钥匙，实验做完后需及时归还，按借还钥匙时间来计算费用。具体标准为每个细胞间按20元/天计算，如果多人共用一间培养房则平摊费用。

3 结束语

本培养室在投入使用以来，也出现了不少的问题，特别是在建设时由于经费有限，只设计安装了一台空调设备，当其发生故障不工作时，培养室的温度无法调控。因此，建议其他实验室在经费充裕的情况下设计两套空调系统。本培养室的隔断全为手工玻镁板，在外面看不到房间内情况，建议其他实验室在设计时可设计部分洁净玻璃窗或者设计安装一套监控系统。四川的空气质量较差，新风口处的滤网会在较短时间内变脏，建议其他实验室在设计新风过滤网时可设计一个多级多层滤网。

总之，随着现代科学研究技术的快速发展，细胞培养室的要求也不断提高，其管理也需要逐步加强。如何建设和管理好适应高等院校科研要求的细胞培养室以促进科研水平的提升是值得探讨的课题。在新细胞培养房的设计和建设时，同行间应相互学习并组织专家进行论证，尽量减少问题的重复出现，从而让新细胞培养房的建设更加科学与合理。