乳酸菌及其检测方法的研究进展

◎ 赵月杰，程海芳，范雯婷，李宜哲

（河南省产品质量监督检验院，河南 郑州 450047）

在发酵食品生产过程中，乳酸菌是使用较多的细菌之一，整个生产过程需要一定的特殊操作，要重点标记一些产量多、性能良好的菌株，从而全方位把控生产质量，提高生产的安全性，并且需要严格控制微生物，而最为有效的是以检测方式来进行，并以此为基础构建检测乳酸菌的手段，对产品质量检验及生产过程控制具有重要意义。现有的检测方法主要分为传统检测方法、分子生物学检测方法和快速检测方法。

1 乳酸菌的分类及生理功能

乳酸菌是可以发酵碳水化合物并产生大量乳酸的一类细菌的通称，在自然界和食品中广泛存在。乳酸菌通常涉及两种类型：①乳酸菌属于同型，在葡萄糖被分解后只有一种最终物质——乳酸。②发酵乳酸属于异型，而最终的产物不仅包括乳酸，同时会出现其他有关物质，如二氧化碳、乙酸以及乙醇等。

乳酸菌在很多地方都存在，比如常见的临床样品、物料以及食品当中都经常见到，同时在很多动物的肠道当中广泛存在，其主要的生理功能有：①一些乳酸菌黏附在机体的肠道中，形成生理性屏障抵御有害菌，通过分泌不同酶类帮助机体消化食物，并为人体的代谢活动提供必需的维生素和氨基酸等物质，同时能够起到传递遗传物质的功能。②乳酸菌能够调节氧化还原电位和pH值，主要是通过自身产生的醋酸和乳酸来抵制环境中有害菌落，从而创造一个良好的生存环境。③乳酸菌通过自身具有抗腐败菌和病原菌的功能对病原菌的定植进行干预，刺激组织发育、制造营养物质、降低胆固醇、控制内毒素以及诱发肠道免疫等，进而对不同机体的应急反应、衰老过程、免疫反应、肿瘤反应、毒性反应、细胞感染、药物效应、营养状态以及生理功能产生一定作用。

2 乳酸菌的传统检测方法

2.1 乳酸菌的形态学观察

作为一种最为普遍的检测方式，形态学观察主要有3种：①通过平板菌落来实现，观察不同培养基、不同温度以及不同时间菌落的变化。②利用光学显微镜，用革兰氏染液染色菌落细胞，然后在光学显微镜下观察，若为革兰氏阳性则初步判断可能为乳酸菌。③电镜观察法。该方法通过透射电镜扫描菌体细胞中的用磷钨酸负染色法染色的染色体，从而得到菌落细胞的表面结构和形态[1]，有时会利用投射电镜观察超切片，可以观察到菌体内部结构[2]。

2.2 乳酸菌的生化鉴定

在生化鉴定过程中，其主要依照表型特征来实施，是生物学鉴定中经常使用的方法，但由于整个操作环节比较复杂，经常发生污染现象，因此，在使用时经常容易受到限制，但是随着生化鉴定条自动化和鉴定管的发展，生化鉴定再次受到重视，但仍旧限制在辨识力方面，因此主要以检测鉴定分支方式参与到鉴定当中[3]。实施生化鉴定时要依照相应特征来实施，其中主要涉及明胶水解、吲哚产生试验、氨基酸脱羧测定、脲酶测定、产氨试验、硝酸盐还原试验、乙醇的氧化、乙酸的氧化、葡萄糖的氧化发酵测定以及糖类、氧化酶醇类的发酵试验等方法。

2.3 测定代谢产物

通过测定乳酸菌的菌体组分或代谢产物的含量实施菌种的鉴定，如分析细胞壁肽聚糖组分、乳酸旋光性分析，分析厌氧菌代谢产物主要有粒子色谱法、裂解法、液相色谱法、气相色谱法以及层析法，使用最为普遍的是液相色谱和气相色谱分析法，依照相关规定和标准，乳酸杆菌和双歧杆菌必须鉴定的项目为属间鉴定，必须使用气相色谱法来实施。

3 分子生物学检测方法

3.1 rDNA/rRNA序列的分子标记

原核生物核糖体rRNA主要包括5S、16S、23S 3种类型，这3种rRNA含有的碱基数量分别为120个、1 540个以及2 900个。rRNA自身具有一定优势，其中包括保守性和高变性，比如确定生物物种是否存在关系时，利用其具有的保守性作为依据分析，而高变性主要体现在核酸序列具有的结构特征方面，因此能够为属种鉴定提供依据[4]。生物发育指标中最为合适的选择是类似的rRNA基因序列和16SrRNA，所以在分析乳酸菌多样性时会利用测量16SrRNA部分序列的方式。但是rDNA/rRNA序列的分子标记法具有一定限制，在实施时只能对部分序列进行分析，因此整体水平受到一定约束，并且整体实施时间比较长，测序成本相对比较高。

3.2 基于基因组DNA水平的分子标记

3.2.1 RAPD

RAPD属于DNA一种，但是归属到多态性和扩增性范围内，主要原理是如果退火温度不高，长度在10 bp上下的随机寡核苷酸单引物，则能够通过结合方式来与DNA序列融合为一体，从而有效扩充引物之间的范围，再通过电脉后的PCR产物能够以多态性方式作为依据实施有效的鉴定。

RAPD在应用时具有很多优势，比如整体操作过程简单，分辨效果较好，在不需要了解基因组DNA序列信息基础上就可以检测，同时，RAPD自身具有一定劣势，要想稳定带型，要确保电脉和PCR扩增条件相同，比较短的扩增引物，并且该方法难以得到良好的重现率，因此通常需要结合其他方法共同使用，比如结合温度梯度凝胶电脉可以鉴定到种水平。

3.2.2 RFLP

RFLP作为一种限制性片段长度多态性检测方式，在用DNA限制性内切酶切割后，得到一定的DNA片段，基因间限制性片段长度差异化主要是由于酶切点的碱基出现缺失、重排以及替换。主要应用流程：利用探针标记DNA片段，并且利用转模、凝胶电脉以及限制性内切酶酶切后得到的DNA片段。近些年会融合PCR技术来实施检验，降低整个检验过程的难度。

3.2.3 AFLP

AFLP指的是扩增片段长度多态性，作为分子标记技术之一，早期发明始于荷兰，在应用过程中与其他类型的物种基因组DNA检测方法有一定不同之处：①获取一系列片段，这些片段含有黏性末端，并且主要通过限制性内切酶切割得到。②在DNA片段末端连接双链寡核苷酸接头，利用选择性引物进行PCR扩增，主要扩增限制性片段，并依照具体的扩增片段长度是否存在来确定多态性。

4 乳酸菌的快速检测方法

目前，乳酸菌鉴定大多仍沿用传统方法，但是传统分析法存在一定缺陷，比如关系密切与表型特性相似不等同、辨识度较低以及重现率较低等，所以要积极探究新的鉴定模式，从而提升鉴定效率，而分子鉴定技术主要以微生物为主，并且在乳酸菌基因组系统以及结构基础上实施鉴定，从而有效发挥鉴定效果[5]。

4.1 实时荧光PCR技术

实时荧光PCR技术在20世纪90年代始于美国，实时荧光PCR技术在实际应用时能够从定性的角度出发来实现定量目标，并且检测过程完全闭管，所以能够防止出现交叉污染的现象。在检测时利用定量PCR仪，并通过激光器电源发挥作用，能保障荧光激发的无干扰、高能以及稳定效果。因此整个检测过程能够发挥操作简捷、损耗低等优势。并且能够有效检测PCR产物积累：用双标记荧光探针可以对基因拷贝数进行定量。

4.2 变性高效液相色谱（DHPLC）

变性高效液相色谱是一种能够应用于微生物群落分析、监测和鉴定的自动化新技术。目前，变性高效液相色谱广泛应用于不同行业当中，比如基因克隆、分析甲基化、分析RNA、诊断人体疾病以及鉴定微生物等，但是在实际应用时，以变性为基本条件，同源双链核酸分子基因多样性检测主要通过异源双链核酸分子来实现。

4.2.1 DHPLC原理

DHPLC主要利用离子对反相液相色谱技术对核酸片段进行分离和分析。由于DNA分子带负电荷，而分离用色谱柱的固相呈电中性疏水性，因此DNA分子本身不能直接吸附到柱子上。TEAA离子对试剂，可充当“桥梁”帮助DNA分子与柱子固相填料表面分子结合，TEAA的阳性铵离子与DNA相互作用，同时烷基链与柱子的疏水表面相互作用。这样DNA分子越长，结合的TEAA越多，与固相结合得越牢固[6]。

4.2.2 PCR-DHPLC检测方法流程

抽取目标检测物中的样品核酸，并通过PCR扩增方式实施产物DHPLC分析，并以有效的条件来分离和洗脱DHPLC条件下核酸片段，收集相关数据、用WAVE System Software分析，获取最终的报告，收集相应片段时可以实施扩增、钝化以及测序[7]。

4.2.3 DHPLC在微生物领域的应用

很多病菌自身基因型存在差异，因此导致的病性也存在不同之处，但是在基因遗传以及相关特性方面存在一定共同点，导致分型细菌出现一定的难度，DHPLC能够分析DNA系列中细小的差异点，从而识别病原菌。DHPLC技术通过自身优势对病原微生物进行准确识别。用PCR引物，扩增多种细菌的16S rRNA基因，获取相应的色谱峰图，并以此作为细菌分类的依据[8]。

PCR-DHPLC技术方法在应用时具有很多优势，比如自动化程度高、通量高以及仪器简便，能够有效降低成本费用，并且随着科学技术的不断创新和发展，PCR-DHPLC检测应用市场将越来越广泛，并且相关软件技术水平的提升能够进一步辅助DHPLC分析系统有效发挥自身作用，应用到更多的行业当中。

5 结语

乳酸菌的快速检测方法越来越受到研究者的广泛关注，其应用前景和应用价值也无限广阔，特别是实时荧光PCR和DHPLC两种快速检测方的研究的逐渐深入，技术日趋完善，打开了乳酸菌快速准确鉴定的大门。