呋喃丹及其代谢产物呋喃酚在大鼠体内的死后分布研究

张文骥

(中国刑事警察学院，沈阳 110035)

呋喃丹(carbofuran，CAR)又名克百威，为氨基甲酸酯类杀虫剂，属于高毒农药，目前在农业上作为玉米等多种作物的包衣种粒而广泛使用[1]。由于获得容易，故经常发生中毒事件。在实际案例中，选取呋喃丹中毒的检材及确定中毒检材的检测指标是法医学鉴定的重点与难点。研究表明，人和动物心血内呋喃丹等氨基甲酸酯类农药存在死后再分布现象[2]，且死后存放较久的情况下不能检出呋喃丹[3]。吴苗苗[4]研究显示，呋喃丹在大鼠体内可发生死后再分布，再分布与死后经过时间、环境温度等有关。本研究在此基础上，通过对提取、检测方法的改进，对地呋喃丹及其主要代谢物呋喃酚(benzofuranol，BEN)在大鼠体内死后再分布规律进行探究，为呋喃丹中毒案件的法医学鉴定提供实验依据。

1 材 料

1.1 试 剂

呋喃丹标准品(99.0%，国家农药质量监督检验中心)、呋喃酚准品(99.5%，上海迈瑞尔试剂)、内标西维因标准品(99.0%，国家农药质量监督检验中心)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯；水为重蒸水。

1.2 仪 器

仪器液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用仪：由Thermo Finnigan液相色谱仪、Thermo Fisher LXQ离子阱质谱仪(美国San Jose公司)组成；FSH-2A高速组织匀浆机(上海汗诺仪器有限公司)；HC-3018R 型高速冷冻离心机(河南兄弟仪器有限公司)。

1.3 动 物

Wister大鼠30只，体重(200±10)g，雌雄不限(辽宁本溪长生生物公司提供，合格证号：SCXK(辽)2015-0001)，适应性喂养3 d。饲养环境：温度20 ℃，湿度40%～60%，通风换气良好，光照合理，喂食营养颗粒饲料和纯净水。本研究所进行的动物实验标准符合机构责任委员会的伦理(道德)标准，可进行大鼠动物实验。

2 方 法

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 Thermo Gold ODS C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，5 μm);柱温35 ℃；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(20∶80)；流速为0.2 mL/min；进样量10 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子检测，SRM模式，扫描范围为70～280 D；毛细管温度为350 ℃。在上述的质谱条件下，呋喃丹、呋喃酚和西维因主要生成[M+H]+准分子离子峰，分别为m/z222，m/z165和m/z202。选择性对[M+H]+进行MS2产物离子全扫描质谱分析，呋喃丹的主要碎片离子分别为m/z165和m/z122，〗呋喃酚的主要碎片离子分别为m/z123和m/z137，西维因的主要碎片离子分别为m/z145。根据其碎片离子的丰度，呋喃丹、呋喃酚、西维因定性、定量离子m/z分别为：222→165，165→123，202→145。

2.2 溶液配制

精密称取呋喃丹标准品、呋喃酚标准品和内标物西维因标准品10，10和20 mg，置于100 mL量瓶中，并加甲醇定容，分别制得呋喃丹标准储备液(100 μg/mL)、呋喃酚标准储备液(100 μg/mL)和西维因标准储备液(200 μg/mL)。分别精密量取呋喃丹标准储备液0.05，0.25，0.5，2.50，5.0，25.0 mL于50 mL量瓶，加甲醇定量稀释成质量浓度为0.1，0.5，1.0，5.0、10.0，50.0 μg/mL的呋喃丹系列标准溶液,备用。分别精密量取呋喃酚标准储备液0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，25.00 mL于50 mL量瓶，加甲醇定量稀释成质量浓度为0.1，0.2，1.0，2.0，10.0，50.0 μg/mL的呋喃酚系列标准溶液,备用。精密量取西维因准储备液1.00 mL于50 mL量瓶，加甲醇定量稀释成质量浓度为4.0 μg/mL 的西维因标准溶液，备用。

2.3 样本提取

将大鼠随机分成6组，置于室温(10 ℃)条件下，分别标记为 0，12，24，48，72和96 h。称取呋喃丹标准品90 mg，磁力搅拌分散于蒸馏水50 mL中，配制成质量浓度为1.8 mg/mL的呋喃丹混悬液。用自制呋喃丹混悬液，在搅拌状态下抽取药液，以4倍LD50(44 mg/kg)灌胃。待大鼠中毒死亡后，按照不同时间点取心血、心、肝、脾、肺、肾、脑、左下肢肌、胃及等组织，-20 ℃冰箱保存待检。

2.4 样本预处理

取样品检材1 g，剪碎，加入内标西维因2 μg和水2 mL，15 000 r/min匀浆3 min，再加入乙腈4 mL，振荡涡旋，离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液2 mL作为样品液。氮气吹干，残渣溶于甲醇100 μL，过膜后取10 μL，按照“2.1”项下条件检测，以内标准曲线法定量。

3 结果与讨论

3.1 HPLC-MS/MS-MRM色谱图和质谱图

呋喃丹及其代谢呋喃酚和内标物西维因的质谱条件及保留时间(tR)和质谱图分别见表1和图1。

Table1 MS conditions and retention time of BEN,carbaryl,and CAR

AnalyteFormulaParent ionDaughter iontR/minCARC12H15NO32221652.28BENC10H12O21651232.30CarbarylC12H11NO22021452.32

CAR：Carbofuran;BEN:Benzofuranol

Figure1 MRM chromatogram of BEN (A),carbaryl (B),and CAR (C)

3.2 工作曲线和回收率

3.2.1 工作曲线

液体检材(方法A)：取空白血浆2.0 mL，分别添加呋喃丹、呋喃酚系列标准溶液及内标西维因标准溶液，涡旋混匀，并按“2.4”项下方法进行测定。

固体检材(方法B)：取检材组织1 g，分别添加呋喃丹、呋喃酚系列标准溶液及内标西维因标准溶液，按“2.4”项下方法进行处理，并进行测定。分别以血浆及肝中呋喃丹(或呋喃酚)质量浓度(μg/mL)为横坐标,以呋喃丹(或呋喃酚)与西维因内标峰面积的比值为纵坐标，进行线性拟合，得线性方程如表2。

Table2 Standard curve of BEN and CAR in blood and liver samples

MethodAnalyteEquationrLinearity range/(μg/mL)ACAR y=0.007 9x+1.4570.999 00.1-50BENy=0.007 3x+1.8650.998 40.1-50BCAR y=0.006 8x+3.626 80.988 10.1-50BENy=0.006 3x+0.077 50.995 20.1-50

3.2.2 回收率 空白检材中分别添加呋喃丹和呋喃酚0.1，1.0，50 μg/mL各3份，按“2.4”项下方法提取及检测，工作曲线法计算呋喃丹和呋喃酚含量及回收率。血液和肝脏中添加呋喃丹及呋喃酚的提取回收率(低、中、高浓度)见表3。

c/(μg/mL)CARMethod AMethod BBENMethod AMethod B0.178.2±3.875.6±3.270.3±1.367.6±5.21.077.5±5.276.1±1.967.4±2.967.2±3.45075.8±2.873.5±2.266.4±2.565.8±3.3

3.3 死后分布

呋喃丹和呋喃酚在Wister大鼠体内的死后分布见表4。

经统计学分析(LSD-t检验，P<0.05)，死后0 h在大鼠体内呋喃丹含量由高至低分布为：胃壁、肺、肝、肾、脾、左下肢肌、心、血、脑，呋喃酚含量由高至低分布为：胃壁、血、肝、肾、脾、左下肢肌、肺、脑、心。结果显示，灌胃染毒后，呋喃丹在大鼠胃壁、肺及肝中含量较高，而呋喃酚则在大鼠胃壁、心血、肝及肾中初始含量较高，说明呋喃丹经灌胃染毒吸收后，主要经过肝代谢。代谢产物呋喃酚及原体毒物呋喃经肾由尿液排出体外[5-6]。结果还显示，呋喃丹在中毒死亡大鼠肺中的初始浓度较高，具有富集作用。这可能是由于流经全身的动、静脉血在肺中完成转换，使肺内部积累了大量呋喃丹造成的，这也符合肺源性的死后分布机制[7]。代谢产物呋喃酚在心血中初始含量较高可能是由于呋喃丹在血液中容易降解[8]，生成呋喃酚。

SpecimenDynamic distribution of CAR and BEN(μg/g)0CARBEN12CARBEN24CARBEN48CARBEN72CARBEN96 hCARBENHeart1.7±1.30.1±0.14.8±1.71.1±0.35.8±1.91.2±0.410.6±3.71.0±0.413.0±4.61.7±0.58.6±5.64.4±2.6Liver10.2±8.91.2±1.09.3±8.32.4±1.713.7±8.62.7±1.829.7±16.14.5±2.766.4±25.65.5±3.515.7±12.110.3±4.9Spleen8.7±3.80.8±0.516.6±5.92.2±1.113.0±4.81.8±0.716.5±9.23.1±1.811.5±4.11.7±1.113.9±5.05.3±2.7Lung16.7±14.30.4±0.25.6±4.90.1±0.18.3±8.00.2±0.17.2±7.00.1±0.110.0±8.8-6.7±6.1-Kidney5.7±4.71.1±0.16.6±6.30.6±0.220.0±10.23.2±0.637.3±29.65.2±1.829.4±24.07.3±2.625.1±13.19.2±1.9Brain0.9±0.70.3±0.26.5±6.20.9±0.46.8±3.21.1±0.99.7±8.11.7±1.31.5±0.60.2±0.11.2±1.00.4±0.3Stom-ach212.4±41.941.5±16.3269.4±60.032.4±22.1183.3±35.328.5±14.5118.6±57.733.9±10.584.5±41.114.7±9.0131.9±23.718.4±6.3Muscle5.4±3.80.3±0.15.1±3.9-6.4±4.30.2±0.18.0±4.20.1±0.76.8±3.00.3±0.35.8±3.3-Blood2,2±2.01.1±0.32.0±1.01.6±0.61.9±1.02.4±0.61.9±0.32.3±0.81.4±0.23.1±1.10.9±0.14.3±1.9

研究结果同时显示，大鼠死后心血、肺、胃壁组织中呋喃丹浓度很快达到峰值，而后呈明显下降。在大鼠死后96 h，其血、肺和胃壁中的呋喃丹浓度与0 h相比，分别降低56.13%，59.90%和37.87%；大鼠心、肝、肾和脑组织中呋喃丹浓度分别在死后72 h、72 h、48 h、48 h达到最高，与0 h 呋喃丹浓度相比分别上升7.6，6.5，6.5和10.9倍，而死后96 h与0 h呋喃丹浓度相比浓度分别上升5.1，1.5，4.4和1.3倍，呈先升高，后下降的特点；大鼠脾中呋喃丹浓度随着时间的变化规律尚不规则；肌肉中呋喃丹浓度随时间延长基本不变。以上结果表明，呋喃丹中毒死亡大鼠体内药物分布存在变化，由胃壁、血及肺组织，向肝、肾、心及骨骼肌组织中转移。药物死后分布的重要原因是组织间药物浓度的差异[7]。胃壁组织中呋喃丹浓度随时间明显下降，可能由于呋喃丹在灌胃染毒致死大鼠的胃壁组织中含量较高，与相邻的肝、肾等组织浓度梯度较大。大鼠死后，虽然药物不能继续通过胃壁等消化道黏膜吸收，但不同组织间残留药物的浓度梯度可驱使呋喃丹从浓度较高的胃壁组织迁移到毗邻的其他组织，这样的“死后弥散”导致了呋喃丹在胃组织周围的肝、肾组织中浓度得到了上升。然而随着死后时间的延长，肝、肾等组织内的呋喃丹浓度并未一直升高，不同组织间的呋喃丹浓度也未得到均化，这是由于呋喃丹易于在体内组织中发生降解生成呋喃酚，这是胃壁、心血、肺组织中呋喃丹含量随时间明显下降的另一个原因。心、肝、肾和脑组织中呋喃丹浓度先升后降，表明在大鼠死亡初期，由于死后弥散的存在呋喃丹的表观降解速率受到抑制，但死后弥散可能只发生在大鼠死后的一定时间内。心血中的呋喃丹浓度并未由于呋喃丹从毗邻的胃壁组织的弥散而出现上升，说明药物在血液中可能存在着更快的降解，这与文献的报道一致[8]。同时，呋喃丹的代谢产物呋喃酚在死亡大鼠心、肝、脾、肾、心血中的浓度均呈上升趋势，与0 h浓度相比分别上升31.2，8.76，6.81，8.32和3.88倍。肺及左下肢肌中呋喃酚浓度较低，且随着时间基本保持不变。脑组织中呋喃酚含量先上升后降低。文献报道，死后尸体内的呋喃丹可继续降解，生成呋喃酚[4]。实验结果证实了这一结论，同时也表明呋喃丹在心、肝、肾和脑组织中后期的含量下降可能主要由于呋喃丹的降解。以上结果表明，呋喃酚在上述检材中含量的增加受死后再分布及呋喃丹死后降解双重影响。

4 小 结

毒物的死后分布是指毒物浓度随着取材部位的不同，检材收集和时间间隔的不同而发生变化，毒物浓度与检材种类和时间的依赖关系[9]。本研究利用HPLC-MS/MS法检测了呋喃丹及其主要代谢物呋喃酚在大鼠不同器官组织中的含量，研究了二者在大鼠体内死后分布的一般规律。经研究证实，受染毒途径、代谢途径、毒物性质等因素影响，呋喃丹及呋喃酚在灌胃染毒大鼠死后不同组织器官中的初始含量分布不同。提示对怀疑呋喃丹中毒的案例，除采集血液外，还应尽可能收集肝、肺等检材进行毒物分析。不同器官组织中的毒物含量随时间变化规律受呋喃丹自身降解及在不同组织间的扩散迁移共同影响。死后分布对呋喃丹及呋喃酚的定量分析均会产生影响，但是呋喃丹降解产物呋喃酚的检出可作为生前呋喃丹中毒的证据。同时，本研究建立的生物检材中呋喃丹及代谢物呋喃酚的HPLC-MS/MS检测方法对于呋喃丹原药、代谢物呋喃酚和内标物西维因的检出互不干扰，方法学考察均满足实际检测工作的需求，可用于呋喃丹中毒案件的法医学鉴定。