凯氏定氮法测定蛋白质的方法分析

◎ 李杉杉

（眉山职业技术学院，四川 眉山 620000）

蛋白质在生物体内非常重要，几乎参与所有的生命活动，蛋白质不仅与新陈代谢、免疫和生物进化有很大关系，而且还提供很多信息。蛋白质含量常作为衡量食品中营养价值高低的一项重要指标，因此蛋白质含量的检测在食品分析中尤为重要，一直以来都是研究的热点。

根据GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，在食品中蛋白质的测定方法有凯氏定氮法、分光光度法和燃烧法[1]。虽然凯氏定氮法操作复杂、试剂消耗大，但其测试结果准确性和重现性好，是目前测定有机化合物含氮量最常用，也是最经典的方法之一[2]。本文分析凯氏定氮法在实际操作中存在的问题。

1 测定原理及仪器

1.1 测定原理

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法[3]，在食品中的蛋白质在催化剂催化并加热条件下，蛋白质分解后的产物氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收游离氨后以标准硫酸或标准盐酸滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量[4]。

1.2 仪器与试剂

（1）仪器。天平、定氮蒸馏装置、自动凯氏定氮仪和消化炉。

（2）试剂。硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、氢氧化钠和95%乙醇。

2 测定方法优点及存在的问题

2.1 测定方法优点

2.1.1 准确度高

凯氏定氮的测定结果相对准确，重现性好，在国内各大检验机构中比较普及。

2.1.2 灵敏度低，抗干扰

凯氏定氮法的灵敏度低、干扰少，适用于0.2～1.0 mg氮，误差为（±2%），且样品使用量少[5]。

2.1.3 应用广泛

凯氏定氮法应用很广泛，几乎适用所有形态的食品，对于一些类似于不溶解的样品，也能适用凯氏定氮法测定蛋白质。

2.1.4 使用设备简单，实验费用低

凯氏定氮法需要的设备相对简单，所需设备和试剂较少，实验设备和试剂价格相对便宜，且实验操作难度小。

2.2 测定过程中存在的问题

2.2.1 消化时间过长

采用凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量所需时间较长，完成整个操作流程需要7～10 h，且试剂消耗量大。

2.2.2 消化过程中易产生泡沫，挂壁，导致消化不完全

食品中的有机物质除了蛋白质外，还有脂肪和糖类等，在加热过程中易产生泡沫附在定氮瓶口或者消化管口，同时消化过程中产生的冷凝酸液不易将吸附物质洗下，导致消化物质减少，测定结果偏低。

2.2.3 消化液易产生结晶、浑浊

待消化完成后，在定容过程可以发现消化液过于黏稠，且有部分结晶物质，导致消化液不澄清、透明。

2.2.4 定氮蒸馏装置搭建复杂，玻璃材质易破碎

常规定氮蒸馏装置由电炉、水蒸气发生器、反应室、冷凝管、接收瓶等组成，组装搭建整个定氮蒸馏装置较复杂，同时各接口处比较脆弱，易破碎。

3 针对问题的解决方法

3.1 改变消化试剂的添加时间、添加量、添加种类

针对消化时间较长问题，可以采用定时定量添加消化试剂，在添加硫酸的基础上，添加少量的过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂可加速有机物的氧化分解。

3.2 消化注意温度的把控，添加消泡剂

针对消化过程中易起泡问题，可以从控制温度上解决。在消化初期温度不需太高，保持消化液微沸即可，待泡沫消化后在徐徐渐进的加强热源，并定期旋转定氮瓶，使挂壁物质消化完全。针对脂肪、糖类含量特别高的食品还可以添加少量消泡剂如辛醇或液体石蜡或硅油。

3.3 注意催化剂的添加量

国家标准中催化剂硫酸铜的添加量为0.4 g，无需多添加。如果添加过量消化结束后消化液冷却后有可能会产生硫酸铜盐结晶，可多加水、加热使之溶解。但是产生的结晶不影响最终蛋白质含量的测定结果。针对消化液不易透明、澄清，可以待消化液冷却后加入少量的过氧化氢后继续消化至澄清、透明。

3.4 采用自动凯氏定氮仪

针对常规蒸馏装置的复杂性、易损性，可以采用自动凯氏定氮仪。不仅操作简单，同时可以缩短常规蒸馏装置加热时间，但是自动定氮仪较常规玻璃蒸馏装置会耗用更过的试剂。

4 结语

作为三大营养物质之一，蛋白质是食品理化分析的重要指标。而目前凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量是各大企业、检测机构采用的蛋白质检测方法之一，也是各高校学生主要学习的方法。凯氏定氮法测定过程中出现的问题均可以解决，需要各企业、机构结合产品自身做出相应调整。