超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中的30种兽药残留

◎ 黄正华

（谱尼测试集团深圳有限公司，广东 深圳 518000）

我国在水生物养殖、禽类饲养以及畜牧业生产等过程中会使用各种兽药，其中包括喹诺酮和青霉素等，这些药物的滥用会对人体产生一定的影响，当人体内的药物积累到一定程度后，就会出现耐药性，甚至导致畸形、突变等严重后果[1]。目前在兽药检测领域中普遍使用的一种方法是超高效液相色谱-串联质谱法。

1 实验方法

1.1 设备与试剂

使用的设备包括超高效液相色谱仪Agilent1290，三重四极杆质谱仪6460，高速冷冻离心机、水浴式的氮吹仪、高纯净水仪、超声波振荡器等。试剂包括甲酸、正己烷、乙腈、甲醇、氯化钠、三氯乙酸、C18吸附剂。实验过程中所使用的水均是通过高纯水净化而来。此外，还包括19种喹诺酮标准品，恩诺沙星、司帕沙星、双氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星、诺氟沙星、萘啶酸、西诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、吡哌酸、奥比沙星、依诺沙星、马波沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、司帕沙星、沙拉沙星等，还有11种青霉素标准品，如苯氧乙基青霉素、双氯青霉素、邻氯青霉素、甲氧苯青霉素、苯咪青青霉素、苯氧甲基青霉素、苄青霉素、乙氧萘胺青霉素、双氯青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、苯氧乙基青霉素等。

1.2 标准溶液的配制

先将喹诺酮标准品使用10毫升的甲酸进行溶解后用乙腈作为溶剂。而青霉素类标准品则以50%乙腈水溶液作为溶剂，然后将30种标准品配制成500 μg·mL-1浓度的单标储备液，并避光冷藏保存。根据所需初始比例流动相进行稀释，从而获得浓度适当的标准混合工作溶液，现用现配。

1.3 预处理方法

称取均质样品5.0 g，置于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入10%三氯乙酸溶液-乙腈（20∶80）的混合液10 mL，匀浆1 min，室温超声提取10 min，于室温以8 000 r·min-1的速度离心5 min，将清液转移到50 mL离心管中，剩余的残留物加入1%甲酸乙腈溶液10 mL进行二次提取，合并清液，加入适量氯化钠，同时添加C18吸附剂0.5 g，涡旋1 min，室温以8 000 r·min-1的速度离心3 min。准确提取9 mL清液于15 mL离心管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL正己烷和1 mL初始比例流动相溶解残余物，旋涡1 min，低温离心3 min，取下清液过0.22 μm滤膜，准备上机检测。

1.4 标准工作曲线的配制

称取阴性样品，根据预处理方法进行处理，浓缩尽干，并加1.2中稀释好的不同浓度标准混合工作溶液1.0 mL，用1 mL正己烷和1 mL初始比例流动相溶解残余物，旋涡1 min，低温离心3 min，取下清液过0.22 μm滤膜，得到标准工作溶液。

1.5 仪器条件及定量

MS条件，30种待测的兽药质谱参数：电喷雾离子源，MS/MS分辨率设置成unit，干燥气温度300 ℃，干燥气流速10.0 L·min-1，鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为11.0 L·min-1。定量的方法：用1.4中的不同浓度标准工作溶液上机机检测，制作标准曲线，用曲线校正1.3得到的样液，保留两对特征离子与时间定性，用离子对峰面积进行定量，外标法计算样品中30种待测的兽药的浓度。

2 结果与讨论

2.1 优化质谱条件

通过电喷雾离子源的正离子扫描模式，系统分析三十种兽药，待测物质都转化成转分子离子峰，属于一种[M+H]+的形式。通过单离子SIM的扫描方法对所有待测物质的裂解电压进行单独优化，找出母离子最佳裂解电压，随后通过SCAN扫描方法对碎片离子进行系统分析，找出最佳碰撞电压，从而得到较好响应的离子对。同时在检测多残留的过程中，通过的多反应动态监测手段来分析样品提高检测结果的准确性与灵敏度。通过多反应动态监测这一手段，能够结合被测组分不同的保留时间，进行分段的MRM扫描，从而提高所有检测物质的扫描时间，提升灵敏度。以下介绍了其中30种药物的质谱参数，具体见表1。

表1 30种药物的质谱参数表

2.2 改善色谱条件

通过分离效果以及时间等因素对3种色谱柱进行了对比分析，主要分析了SB-C18柱、SYMNETRYSHIELD RP18柱和ECLIPSEPLUSC18RRHD柱3种色谱柱。其中，RP18柱酸性流动相体中对于青霉素药物的重现性和峰形并不是十分突出。SB-C18柱的整体分离结果会对DMRM参数的制定产生影响，结合各种因素，最后选择C18RRHD柱，能都获得预期结果。

结合相关文献资料以及以往分析经验[2-3]，在酸性流动相下能够促进被测物质的离子化，有效提高灵敏度，此次研究中主要是通过组合乙酸铵溶液、甲酸水溶液、甲醇以及乙腈等溶液，并分析其灵敏度与分离效果，随后挑选出最为适合的流动相体系，最终结果证明，将乙酸铵与甲酸添加到水相中都能促进灵敏度的有效提升。从系统平衡消耗时间以及便捷性等角度进行分析，在此次实验中主要是水相加入甲酸，经过不断试验后，选择含量为0.2%甲酸溶液为流动相，能够得到最佳效果。和甲醇比较起来，乙腈反相洗脱能力更好，同时基线噪音影响也比较小，增加了洗脱程序的灵活性，为此可以将乙腈选定为有机相，提高洗脱稳定性。用0.2% 甲酸水溶液作为水相，0.2%甲酸乙腈溶液作为有机相，通过分析猪肉样品，空白谱图我们能够发现，这一环境下没有任何干扰物。

2.3 创新预处理方法

和乙酸乙酯、丙酮、甲醇等比较常见的提取剂相比，乙腈在提取高蛋白样品过程中的沉淀效果比较突出，但是在浓缩最终阶段依然会发生浑浊等问题，通过将一定量的三氯乙酸添加的提取液当中，能够适当减少浑浊问题，结合青霉素这一类型药物在酸性状态中稳定的特点，可以将乙腈和三氯乙酸充当提取溶剂，随后通过1%甲酸乙腈进行二次提取。

2.4 考察基质效应

因为超高效液相色谱-串联质谱法从原理层面分析，基质不能全部消除，因为经常会利用内标法、标准添加法以及稀释法等修正基质效应中的误差。此次研究过程中主要是利用优化洗脱程序有效降低了基质效应。

2.5 检测实际样品

根据相关实验流程从市场流通商品中购买19份猪肝、26份鱼肉以及61份猪肉进行检测，从而对30种兽药进行快速检测，结果发现1例恩诺沙星的阳性猪肉样品，1例环丙沙星的阳性鱼肉产品，随后将阳性的鱼肉产品与猪肉产品和国家下发的标准方法进行比较分析。结果显示，这3种检测方法的最终结果大致相同，见表2。证明此方法可以应用于残留兽药快速检测工作。

表2 各种方法的样品检测结果表

3 结论

本文采用超高效液相色谱-串联质谱法对11种青霉素类型以及19种喹诺酮类型在内的30种残留兽药进行检测。其中通过三氯乙酸乙腈溶液来提取样本，再利用C18吸附剂和氯化钠对提取液进行吸附和分层后进行浓缩，经过正己烷脱脂后，采用多反应动态监测扫描方式进行测试。和目前我国文献报道以及国家标准的相比较，超高效液相色谱-串联质谱法具有较高的灵敏度与准确性，同时简化了其中比较复杂的预处理过程，更加便于操作，能够满足兽药残留检测的实际需求，可为动物源性食物中各种兽药残留的定性和定量分析提供参考。