受体相互作用蛋白3在心血管疾病中的新进展

谢田田 刘婷婷 综述 芮涛 审校

(江苏大学附属人民医院，江苏镇江212002)

冠心病、高血压等心血管疾病在中国的发病率正逐年上升，从细胞死亡机制上寻找有效的心血管疾病的防治方法是目前研究的重要方向，而对信号通路的抑制是外源性阻止细胞死亡的主要途径。由于细胞凋亡的可调控性，在过去的几十年里，大量的研究用于寻找抑制凋亡通路的药物从而减少细胞的死亡，但在心血管疾病诱发的心肌死亡细胞中，如急性心肌梗死，凋亡细胞所占比率不到1%，绝大多数是坏死细胞[1]。另有研究报告称，细胞凋亡在心脏衰竭中起着很小的作用，细胞凋亡水平比坏死低7倍，女性比男性低2倍[2]。凋亡和自噬有可严格调控的死亡机制，坏死曾经被认为是一个偶然、不受调控、不可逆的过程，但目前研究认为坏死分为被动坏死和程序性坏死[3]。前者是一个不受控制的过程，一旦发生，几乎不可能停止。与此相反，后者受到严格调控，而受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIP3)是程序性坏死中起关键调控作用的分子蛋白[3-6]，因此对RIP3进行相关研究对心血管疾病中心肌细胞的死亡具有重要的意义。

1 RIP3结构及功能域

RIP3属于苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶家族，该家族成员RIP1～RIP7各自拥有相似的N-末端激酶区域及不同的C-末端功能区域，C端功能域是每个RIP1～7各自功能起决定作用的关键部分[3,6]，如RIP1 C-末端为死亡结构域，RIP2 C-末端为caspase活化和募集结构域。RIP3是研究相对较多的RIP家族成员之一，RIP3最早由Sun等[4]发现，共由518个氨基酸组成，其C-末端属于特殊的结构域，在RIP3 C-末端一段含16个氨基酸的片段与RIP1的中间领域区高度同源，即RIP同型结构域(RIP homotypic interaction motif,RHIM)[7]。N-末端具有RIPs家族相同的激酶结构域，且其活性中心位于K50A[6]，接着在后期的研究中再次发现，在RIP3的K45A处进行突变能使其丧失与RIP1的结合活性[5]，已有文献指出，在293E细胞，RIP3(K50A)激酶活性消失，并且证实了RIP3是自身磷酸化蛋白激酶，之后Chen等[7]在2013年确定RIP3磷酸化位点位于Ser232(鼠源)/Ser227(人源)，磷酸化位点的发现成为了其他相关研究的重要依据。

2 RIP3介导程序性坏死

细胞死亡的研究大多数开始于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α[8]，多年来，大多数关于TNF-α诱导的细胞死亡都集中在细胞凋亡上，然而，TNF-α也诱发了RIP3介导的细胞程序性坏死，细胞程序性坏死和凋亡的一些上游信号因子是共享的[8]。TNF-α信号通路主要包括复合体Ⅰ、复合体Ⅱa和复合体Ⅱb的形成，RIP3的存在与否及其转录后修饰，如泛素化和磷酸化对细胞的生物学结果具有重要的调控意义。

早期研究表明TNF-α与TNF受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)结合后招募TNFR1相关DD蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)、 RIP1、TNFR相关因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)、细胞凋亡抑制因子1/2、E3泛素连接酶、线性泛素链组装复合物构成复合体Ⅰ，诱导细胞炎症反应[9-13]。复合体Ⅰ促进TRADD、 Fas死亡结构域相关蛋白、caspase 8酶结合形成复合体Ⅱa。当细胞凋亡抑制因子1/2被抑制或降解，RIPK1、RIPK3、Fas死亡结构域相关蛋白和 caspase-8相结合形成复合体Ⅱb，RIP3发生泛素化，诱导细胞凋亡，当caspase-8抑制剂Z-VAD-FMK存在的情况下，RIP3发生自磷酸化[14]。有文献报道，应激条件激活的RIP3会发生分子量的改变[15]。并且RIP3通过RHIM与RIP1相结合并招募混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)共同形成死亡小体，在死亡小体形成的过程中，RIP1和MLKL也发生了磷酸化，并且RIP3的自磷酸化促进了RIP1与MLKL的磷酸化，激活的死亡小体导致了细胞程序性坏死[6,11]。

TNF-α并不是唯一的上游调节通路，其他死亡受体及Toll样受体和细胞内的触发因子如DNA依赖的干扰素调节因子激活物、受体蛋白激酶受体也被证明会诱导程序性坏死[14,16]，热休克蛋白70相互作用蛋白可通过调节RIP3的泛素化对程序性坏死起调节作用[17]。

3 RIP3与核因子κB的相互作用

在RIP3下游仅只是证实与核因子(NF)κB的激活密切相关，NF-κB的激活可促进促炎细胞因子和趋化因子的分泌，有文献报道细胞RIP3基因敲除的小鼠对TNF-α诱导的NF-κB的活性并不会产生影响，也有研究表明RIP3可通过磷酸化RIP1抑制TNF-α诱导的NF-κB活性[5,7]。因此，RIP3与NF-κB之间的相互关系及RIP3是否对其他的信号分子产生影响有待更多的研究去发现。

4 RIP3在心血管疾病中的最新研究

RIP3广泛地表达于机体的各个组织和器官并发挥着重要功能，包括肝脏、脾脏、胰腺及心脏等，但在生理状态下，心脏的RIP3表达量非常少，远不及在胰腺中的表达；但当发生心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤及脓毒血症等反应时，RIP3在心肌细胞的表达会明显增加，并且参与调节心肌细胞的程序性坏死[15]。

4.1 RIP3与冠状动脉粥样硬化

冠心病是最常见的心血管疾病，动脉粥样硬化的病理基础是动脉内膜的脂质沉积、粥样斑块形成而致使管腔狭窄，管壁变硬，使相应器官缺血性改变。动脉粥样硬化被认为是一种慢性炎症过程，在血管内皮细胞遭受损伤的同时，血小板表达的黏附分子增高，γ干扰素、白介素-1等炎症因子分泌增加并刺激单核细胞趋化蛋白-1表达，导致单核-巨噬细胞在内膜下不断增殖并聚集发展成粥样斑块，巨噬细胞在粥样斑块的形成和发展中起着重要作用。Lin等[18]通过研究发现在动脉粥样硬化进展早期，巨噬细胞死亡的方式主要是凋亡，可抑制动脉粥样硬化的发展，而在进展期，约半数以上死亡的巨噬细胞与依赖RIP3的程序性坏死相关，且动脉粥样硬化进展又促进RIP3的表达。Meng等[19]发现在ApoE-/-与Ldlr-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，炎症反应被激活，进一步用ApoE-/-RIP3-/-与ApoE-/-RIP3+/+相比较，前者包括白介素-1β在内的10个炎症细胞因子的信使RNA表达水平显著降低，且RIP3的缺失减少了ApoE-/-动脉粥样硬化的面积，这为RIP3在冠心病的发生发展中提供了研究依据。

4.2 RIP3与心肌梗死

在急性缺血、缺氧时，由于心肌细胞内的ATP迅速消耗，导致大量心肌细胞坏死，而再灌注治疗虽然能挽救部分心肌，但也会造成进一步损伤。线粒体膜渗透性转换(MPT)已被证实与细胞凋亡及坏死相关[2]。ATP作为一切生理活动的重要能源来自于线粒体，当ATP水平维持时，早期的线粒体膜渗透作用改变可能会促进细胞凋亡。然而，当ATP水平在应激条件下(如急性缺血)超过一定的阈值时，线粒体膜的通透性发生改变，线粒体通透性转运孔开放及浆膜破裂，导致细胞坏死，释放乳酸脱氢酶及肌钙蛋白[20]。相关研究表明，RIP3招募RIP1形成死亡小体过程中，线粒体活性氧(ROS)的释放促进了RIP1的磷酸化，使细胞死亡信号通路从凋亡转化为坏死，并且，RIP3能通过调节依赖cyclophilin-d的MPT促进细胞程序性坏死[21]。外源性表达的RIP3分布在线粒体，Luedde等[15]通过左前冠状动脉结扎建立心肌梗死动物模型，并通过共聚焦激光扫描免疫组织化学分析证实了心肌细胞坏死时线粒体主要分布在核周，新生小鼠心室肌细胞中过表达的RIP3也分布在核周，并且，对新生小鼠的RIP3抗体与线粒体共染色后，发现它们处于相同的位置，进一步说明了心肌细胞中RIP3在线粒体表达。前文已提及细胞坏死主要是线粒体膜渗透性改变，导致细胞膜破裂，并伴随ROS及炎症细胞释放的增加，Luedde等[15]在敲除RIP3后，发现ROS的释放及炎症细胞的分泌明显减少，验证了RIP3在心肌梗死导致的细胞死亡中发挥了一定作用。

4.3 RIP3与心室重塑及心力衰竭

成年心肌细胞属于有丝分裂终分化细胞，自我增殖能力有限，当持续的缺血或缺氧或其他刺激因素引发一连串的信号传导事件导致细胞死亡时，心肌细胞的丧失导致剩余存活细胞不能负荷心脏工作要求，从而导致心脏功能的衰退[22]。长期心脏功能障碍最终都将进展为心力衰竭，其发病机制主要是由于心室重塑、Ca2+体内平衡失调、氧化应激反应、蛋白酶的活化及心肌细胞的丧失等。Guo等[23]发现TRAF2通过上游信号蛋白TRADD及下游信号分子TAK1调节了RIP1-RIP3-MLKL坏死信号，TRAF2-/-小鼠心脏出现病理性重塑和功能障碍，敲除RIP3可逆转心室重塑，Luedde等的研究也证实了RIP3的缺失可抑制心室重塑[21]。另有研究表明敲除RIP3小鼠经缺血再灌注或多柔比星处理过后心肌梗死面积减小，心肌细胞死亡数量减少，更不易发生心力衰竭，并且，心肌细胞内RIP3会激活依赖钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ信号通路，导致MPT，引起细胞坏死[24]，进一步证实了RIP3在调节心脏病理性重塑和心力衰竭中的重要性[20,25]。

5 小结与展望

综上所述，RIP3与心血管疾病的发生发展密切相关，而与RIP3相关信号通路的研究甚少。Nec-1已被证实能抑制RIP1的激活,并在心肌缺血再灌注损伤中起保护作用[26-27]，磺胺类药能通过抑制MLKL抑制人类细胞死亡小体的活性[28]，抗肿瘤药帕纳替尼和帕唑帕尼通过作用于RIP1和RIP3抑制程序性坏死[29]。不同于其他细胞，心肌细胞产生RIP3并不需要TNF刺激，并且对分离心肌细胞的研究发现RIP3的心脏毒性是独立于RIP1与MLKL诱导心肌程序性坏死，RIP1与MLKL的激活在RIP3调节心肌细胞程序性坏死中并不是必须的[15,26]，因此RIP3在调节心肌细胞坏死中具有更重要作用，发现更多联系RIP3的蛋白及基因可为心血管疾病的治疗提供新的线索，是否有更多药物能通过调节RIP3对心血管疾病中心肌细胞的坏死产生抑制作用，这一点有待进一步研究和探索。