血浆热灭活处理在Nijmegen法检测遗传性凝血因子Ⅷ抑制物中的应用*

李 刚，刘 怡，吴润晖，陈振萍

(儿童血液病与肿瘤分子分型北京市重点实验室/教育部儿科重大疾病研究重点实验室/首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心 100045)

血友病A(HA)是由于遗传性凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致遗传性出血性疾病。中、重型患者主要表现为自发关节出血，且大多在儿童期起病，治疗仍以输注血源性或基因重组FⅧ制剂为主[1]。获得性FⅧ抑制物是目前最严重的并发症，其导致替代治疗无效、增加治疗难度及费用、甚至增加出血风险[2]。既往报道HA患儿FⅧ抑制物的发生率为3.9%～30.0%，FⅧ抑制物监测是HA患儿临床替代治疗评估的关键[3-4]。因此，有必要选择一种兼具灵敏度和特异度高的方法来检测FⅧ抑制物滴度，以指导临床早期识别和筛查，避免无效输注，为及早调整治疗方案赢得时机。目前Nijmegen-Bethesda法是检测FⅧ抑制物滴度的金标准，国内开展FⅧ抑制物定量检测的实验室也多采用改良的Nijmegen法，但此方法依然有一定的局限性，如变异系数高及残留内源性或外源性FⅧ的干扰，尤其是血浆中残余FⅧ较多时，对抑制物滴度的计算存在一定影响。本研究通过对Nijmegen法增加待测血浆热灭活处理过程，分析其对抑制物阳性或阴性患儿血浆的影响，以期进一步提高FⅧ抑制物检测方法的特异度和灵敏度。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年3月至2017年7月于本院血友病门诊接受诊治的重型或中间型HA患儿52例。依据世界血友病联盟推荐的HA严重程度分型标准进行分型[5]。同时选择50例凝血功能正常患儿的血浆作为质控。

1.2仪器与试剂 所有检测在ACL TOP500全自动凝血仪上进行，基于测定活化部分凝血活酶时间(APTT)的一期凝固法检测FⅧ的活性(FⅧ:C)。乏FⅧ血浆、定标血浆、正常水平质控血浆及特殊水平质控血浆等试剂均购自美国IL公司。

1.3方法 抽取所有患儿静脉血2.0 mL，3.2%枸橼酸钠抗凝，2 500 r/min离心15 min，分离待测血浆，分装后保存于-80 ℃冰箱备用。血样处理在1 h内完成。所有患儿均接受过外源性FⅧ输注治疗，且超过72 h洗脱期后进行检测。

1.3.1正常混合血浆制备 50例凝血功能正常的患儿血浆经同上述方法采集标本混匀后加入固体咪唑，浓度达到0.1 mol/L，在4 ℃条件下，缓慢滴入浓度0.1 mol/L的盐酸溶液至pH值为7.4，分装后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2FⅧ抑制物滴度检测 同一样本分装两等份，分别采用Nijmegen法[6-7]及增加血浆热灭活预处理的Nijmegen法平行检测。

1.3.3血浆热灭活预处理步骤 将患儿血浆在56 ℃水浴加热30 min后离心取上清液后再行Nijmegen法检测FⅧ抑制物。

1.3.4抑制物滴度 即受检血浆灭活正常血浆中FⅧ的能力，以Bethesda单位(BU)来计算。1 BU：37 ℃孵育2 h后，中和外源性添加一个单位FⅧ的50%的抑制物量。抑制物滴度>5 BU为高滴度抑制物；≤5 BU为低滴度抑制物[8]；抑制物滴度<0.6 BU为阴性；≥0.6 BU为阳性。

1.4统计学处理 应用SPSS19.0软件进行统计分析。计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验；非正态分布的计量资料采用中位数和四分位数间距[M(P25,P75)]表示，组间比较采用秩和检验；对抑制物滴度水平的比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1一般情况 入组52例HA患儿，中位月龄为34(3，150)个月；重型39例(75.0%，FⅧ:C<1%)、中间型13例(25.0%，FⅧ:C为1%～5%)。52例患儿由原Nijmegen法检测无抑制物病史24例(46.1%)；有抑制物病史28例(53.9%)。所有HA患儿均采用两种方法进行FⅧ抑制物滴度检测。

2.2两种方法检测抑制物的阳性率比较 对两种方法检测抑制物滴度的结果显示，无热灭活处理组中抑制物阴性24例，抑制物阳性28例，阳性率为42.3%。热灭活预处理组中抑制物阴性者22例，抑制物阳性者30例，阳性率为57.6%。热灭活处理组的阳性率略高于无热处理组，但两种检测方法阳性率差异无统计学意义(P=0.205)。其中2例样本在无热灭活处理组中抑制物滴度均小于0.6 BU，而进行血浆热灭活处理后抑制物滴度为0.6、0.7 BU。此样本的血浆FⅧ:C为4.1%、4.5%。

2.3两种方法检测抑制物滴度水平比较 两种方法检测结果一致的22例阴性样本及28例抑制物阳性样本滴度值进行比较分析发现，在抑制物阴性组中，血浆热灭活处理组抑制物滴度[0.37(0.17，0.48)BU]明显高于无热灭活处理组[0.12(0.02，0.34)BU]，差异有统计学意义(P<0.01)；在抑制物阳性组中，热灭活处理组抑制物滴度为24.1(1.69，95.3)BU，无热灭活处理组为24.8(1.77，105.29)BU，二者差异无统计学意义(P>0.05)，且两种方法检测的抑制物滴度水平之间呈明显正相关(r=0.990 8，P<0.000 1)。

3 讨 论

FⅧ抑制物属于IgG型抗体，作为一种免疫球蛋白，可抑制FⅧ：C，其在体外及体内，均具有时间、温度、pH值依赖性[9]。部分FⅧ抑制物可不表现抑制活性，而是通过与FⅧ抗原的结合形成免疫复合物，免疫复合物的清除缩短了FⅧ:C半衰期，从而影响疗效。Bethesda法是FⅧ抑制物的定量检测方法，其缺点是当抑制物水平较低时，这种方法对FⅧ抑制物检测缺乏特异性。Nijmegen方法在Bethesda法基础上进行了改进，对于检测低滴度抗体特异性较好，已成为国际上推荐检测抑制物的标准方法[6]。但如果血浆中残余的FⅧ:C较高时，会影响抑制物检测结果的准确性，且随着小剂量预防治疗的普及，抑制物阳性患者接受免疫耐受治疗同时需监测FⅧ抑制物的滴度变化观察疗效，能够定量检测抑制物的大型医疗单位逐渐增多，如何准确快速检测抑制物滴度是检验医生需解决的问题。因个体间外源性凝血因子代谢差异，替代治疗后洗脱时间不充分、乏FⅧ血浆中仍存在少量的FⅧ等原因均可导致检测结果不准确。世界血友病联盟推荐使用58 ℃下将待测血浆热灭活90 min来消除血浆中残余的FⅧ。王健琨等[10]通过改良Nijmegen方法，对待测血浆进行58 ℃水浴90 min预处理，其FⅧ抑制物检出较原Nijmegen方法特异性更高。

针对凝血因子在56 ℃条件可完全失活而耐热免疫球蛋白即抑制物仍能保持其生物活性这一特点，本研究对Nijmegen法增加56 ℃热灭活30 min的预处理步骤，结果提示增加热灭活处理的检测结果可信。抑制物阴性样本增加热灭活过程后滴度水平明显增高，且其中2例应用Nijmegen方法检测为阴性的样本采用热灭活处理后其结果为阳性，其原因在于热灭活环境下FⅧ与其他凝血因子同时被灭活，导致检测体系中参与凝集反应蛋白水平降低，基于一期凝固法的APTT相应延长，提高了抑制物滴度检测的灵敏度和特异度。DE LIMA MONTALVAO等[11]的研究结果也提示56 ℃下血浆灭活30 min可以提高血浆中含有残余FⅧ抑制物检测的灵敏度。比较两种方法检测抑制物滴度，结果显示，差异无统计学意义(P>0.05)，主要是由于待测血浆中与FⅧ相抵抗的免疫球蛋白起主导作用，血浆中残余的凝血因子可以忽略，且灭活前后耐热蛋白并无消耗，在反应体系中仍发挥生物学效应，滴度水平无显著差异。同时证明，Nijmegen方法增加血浆热灭活预处理步骤对试验结果无影响，不会出现假阴性结果，并且此方法较之前的58 ℃热灭活90 min时间上明显缩短。基于以上结果，建议对于HA患儿的血浆样本可通过血浆纠正试验对抑制物滴度进行初步预测，纠正试验提示抑制物阳性且满足3 d洗脱期的样本不必灭活凝血因子可直接检测[12]；抑制物阴性及取血前输注凝血因子的样本需增加热灭活过程，提高抑制物检测的灵敏度和特异度，避免假阴性。

随着血友病预防治疗开展，替代凝血因子产品使用量的增加，抑制物检测的重要性得到了临床医生的广泛认可。值得注意的是，Nijmegen方法检测抑制物滴度建议待测血浆中FⅧ的水平要低于5%，如超过5%则需要通过人为补偿待测混合样本中FⅧ等方式予以纠正。轻型HA患儿自身含有一定量FⅧ，中、重型HA患儿输注因子后未达到洗脱期时间体内仍残存FⅧ。本研究增加凝血因子蛋白灭活过程可避免自身凝血因子干扰抑制物检测。国内不同实验室间的检测结果仍存在较大的差异，其中部分原因可能是由于残余的FⅧ对试验结果的影响，增加56 ℃血浆灭活凝血因子过程操作步骤简便，有望成为Nijmegen法抑制物检测前期常规开展的必要步骤。