猪精液常温保存的影响因素分析

孙 超，李 琦，李井春，魏国生

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

21世纪以来，我国养猪业发生了翻天覆地的变化，逐渐由原来以散养户为主转变成现在的集约化生产，在此发展历程中，人工授精技术被广泛应用［1］。人工授精技术的核心是对猪精液的保存，目前保存猪精液的方法可根据储存温度分为3种：第1种是在15～25℃常温下保存，第2种是0～4℃低温保存，第3种是超低温-79℃（干冰）或-196℃（液态氮）保存。在低温保存条件下，冷冻猪精液的某些成分会丢失，导致受精率下降［2］，加之制冷的设备价格昂贵，因此，不能在生产中推广应用。与低温保存的精液相比，常温保存的精液具有受孕率高、费用低、人工操作方便等优点，因此，猪精液常温保存技术在生产上具有很大的应用价值［3］。然而，精液体外常温保存能否成功，还取决于稀释液的组成成分，何种抗氧化剂的添加及其剂量等多种因素［4］。该文主要以常温保存精液的条件下，对影响猪精液保存的不同因素进行系统综述，以期为猪精液保存技术的研究与应用提供参考。

1 温度

温度是外界环境中影响精子的质量最重要的因素［5］。温度较低时，精子的活动会减缓，能量消耗降低，有害物质的生成减少，抑制精液中微生物的生长，并延长了精液体外的保存时间。研究表明，猪新鲜精液保存在15～20℃的温度下，2 d后顶体完整率和精子存活率都优于4℃和39℃的效果［6］。鲜红等［7］发现，猪精液体外保存适宜的温度为14～18℃，当温度低于14℃或超过18℃时，则会使精液的体外存活时间缩短。林峰等［8］研究表明，在相同条件下时，温度在15～20℃时保存精液的效果最好，而在25℃时的保存效果较差。一般来说，猪精液常温保存比较理想的温度为15～18℃，但在实际生产中通常用16～18℃作为保存温度，在这个温度内保存的精子的运动和代谢水平都会下降，精子处于休眠的状态，但此时的精子并没有丧失活力，精子的结构也没有被破坏，当精子恢复在猪体内的温度37℃时，精子可以恢复到正常的运动和代谢水平。

2 精子浓度和稀释倍数

精液是由精子和精清组成，精清中含有一些损伤精子功能的物质，如精清中的芳基磺胺酶能促使精子获能，加速其死亡［9］，因此，除去精清或稀释精液的浓度都有利于精子的保存。当精液稀释后，精子的浓度大小都会影响精液的保存时间，精子浓度越高，精子储存时间越短；而精子浓度过低，则会导致精子失去运动能力和代谢活性，甚至丧失受精能力［10］。精液的稀释浓度应在适宜的范围，既要考虑人工授精所需精子的总数，也要考虑稀释后精液的体积。在人工授精时，液态保存猪精液的正常浓度为3.0×107～5.0×107个精子/mL时，可保证每头母猪受精的总精子数为3.0×109～4.0×109个精子/mL以及80～100 mL的适宜精液用量［11］。

3 抗氧化剂

精子的呼吸代谢会产生活性氧簇 （ROS），其携带有氧自由基，可引起精子过氧化损伤，并导致精子受精能力下降。因此，可在精液中添加抗氧化剂［3］，抑制精子产生ROS。但不同种类的抗氧化剂的作用机理不同，且不同的抗氧化剂在猪精液中添加的剂量不同，作用效果也不尽相同，因此可根据不同的需求选择合适的抗氧化剂。

3.1 谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是一种重要的还原性物质，属非蛋白巯基化合物。GSH主要作用是防止蛋白质分子和重要的酶分子被自由基等有害物质氧化，因此它可以和ROS发生反应，降低H2O2的浓度，对维持机体内氧化还原反应起着重要的作用。精液中含有许多种有害的氧化物质，因此，GSH可直接与其结合，生成氧化型谷胱甘肽和水，从而保障精液的品质［12］。

3.2 VE

VE在细胞膜上具有特殊的亲和力，可占据细胞膜上的特定位置，有效防止过氧化物对细胞膜的损伤，既可以保护细胞膜的完整性，又可提高精子的质量，因此，一直作为精子保存期间的抗氧化剂［13］。陈晓英等［14］研究发现，向稀释液中加入适量的VE可以降低精子顶体的畸形率，有效减缓外部环境对精子的损伤，从而提高精液的品质。但到目前为止，猪精液稀释液中VE的最佳添加剂量仍未有统一的定论，需进一步的研究［15］。

3.3 牛磺酸

牛磺酸（Taurine），也称 β－氨基乙磺酸，是一种含硫的非蛋白氨基酸，具有广泛的生物学效应和相对稳定的化学性质，主要以游离的形式存在于动物的体内，Taurine的主要功能是提高机体的免疫能力，有效清除自由基，增强细胞膜的抗氧化能力［16］。谢东淇等［17］发现稀释液中添加 5 mmol/L Taurine就能增强精子的存活率，提高顶体的完整率，降低精子的畸形率，保护质膜完整性，进而增强其抗氧化性能，最终延长精子体外的保存时间。

3.4 牛血清蛋白

牛血清白蛋白（BSA）是一类对精子受精能力有提高的蛋白保护剂。研究表明，BSA对精子的保护作用，主要有以下三个方面，首先，BSA可以除去精子膜中的部分胆固醇，优化质膜的脂肪水平，并改变质膜的稳定性［18］；其次，BSA可以抑制精液中Ca2+进入胞内［19］，能够中和精子和细菌代谢的副产物，发挥一定的缓冲和抗氧化的作用［20］；最后，BSA能弥补稀释精清中蛋白类运动激活物的下降，维持精子的运动，减少稀释造成的精子头部带相反电性电荷所引起的头对头凝集［9］。

4 稀释液的pH值

pH值是精子生存环境的一项重要指标。戈新等［21］认为，精子在保存过程中产生的代谢产物是酸性的，需要适量的碱性稀释液进行中和，可以有效减少因稀释液过酸而导致精子的死亡。侯丽鹏等［22］研究同样表明，弱碱性稀释液更有利于精液在17℃保存，这是因为弱碱性稀释液更符合精子的生存环境，增强了精液保存效果。

5 缓冲液

缓冲液可以维持稀释液中pH值的动态平衡，有保护精子的作用。Johnson 等［12］研究表明，Tris缓冲液具有较强的缓冲能力，对精子产生的酸性代谢物能起到良好缓冲作用，更利于精子的体外保存。此外，向稀释液中添加碳酸氢钠或柠檬酸钠等缓冲剂可以平衡精子的代谢产物，维持精液pH的相对稳定，促进精子的体外保存［3］。

6 其他因素

尿液对精子也有一定的影响。残留在泌尿生殖道中的尿液会伴随射精与精液一起排出，因此，刚射出的精液应舍弃。此外，相当多的公猪都会有包皮腔积尿的问题，因此，采精时，要先把积尿排出之后再采精，尽量保证采精的质量。此外，精液运输过程中，多数采用加冰袋的泡沫箱运输精液，因此，避免温差大而使精子死亡，可用纱布包裹输精瓶，条件允许情况下可以采用车载冰箱运输。

在实验室操作时，精液瓶每天被数次拿进拿出恒温箱，精液的温度忽高忽低，对精子的保存效果具有很大的影响，因此应尽量减少开关保存箱门的次数和开门的时间，且操作时应当迅速而平稳，防止温度频繁变化和细菌交叉感染对精子造成不良刺激。研究表明，当精液保存在常温恒温箱中时，精子将会于2 h后进入休眠状态，其代谢会减缓，从而存活时间得以延长。然而，为了避免精子沉淀而造成精子死亡，沉淀的物质能够在稀释液中均匀分布，且防止其代谢物积累而对精子产生毒害作用［23］。因此，在精子储存期间，应每12 h摇匀精液1次，摇动时动作要轻缓［24］，剧烈的振荡会导致精子从颈部断裂，形成畸形精子。

7 展望

人工授精是现代畜牧业的一项重要技术，精液的保存技术可以极大地促进猪优秀基因的扩散，还有助于控制某些病原体的传播。但猪精液体外保存的时间较短，所以猪精液体外保存技术还应进行深入的研究和探讨。稀释液中添加抗氧化剂仍是今后猪精液常温保存技术研究中的发展方向。