马传染性贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验常见问题浅解

潘永娜

（辽宁省大连市普兰店区动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116200）

兽医实验室中，常利用琼脂凝胶免疫扩散试验对马传染性贫血病进行诊断和检疫。

1 定义与原理

将可溶性抗原与相应的抗体混合，当两者的比例合适，并有盐类存在时，即有沉淀物出现，这种现象叫做沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原，与沉淀原起反应的抗体叫沉淀素。

主要是采用双向双扩散试验，即用已知抗原、阳性血清、待检血清在琼脂凝胶中进行免疫双扩散，室温下作用24小时，当已知抗原和阳性血清间出现明显沉淀线，抗原和待检血清间也出现沉淀线且与阳性血清沉淀线相连，表明待检血清中有相应抗体。

2 操作细节

2.1 试 剂

（1）标准阳性血清、标准阴性血清、琼脂扩散抗原：指定生物制品厂购买

（2）受检血清：采血分离血清，4℃冷藏保存不含防腐剂和抗凝剂

（3）琼脂糖、硫柳汞：分析纯

（4）pH7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）

2.2 器械和设备

（1）培养箱

（2）平皿：规格直径90mm，洁净灭菌

（3）打孔器：七孔梅花形、孔径约5mm，孔距为3mm

（4）分析天平

（5）微量移液器及吸头

（6）三角烧瓶

（7）酒精灯

2.3 操作步骤（方法）

（1）凝胶的配制：取琼脂糖1.0g，直接加入含有0.1‰硫柳汞的100mL的PBS中，用热水浴溶化混匀。

（2）制板（浇板）：将平皿放在水平台上，每平皿倒入热溶化的琼脂液15～18mL，厚度约2.5mm左右,自然冷却。

（3）打孔 ：在琼脂板上选好位置，用打孔器打孔。用直径3mm打孔器，孔间距为5mm。

（4）挑孔：挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。

（5）封底：为防止渗漏，将打孔后的琼脂板在酒精灯火焰上方快速来回5～7次加热封底。

（6）滴加抗原和血清：在七孔型的中央孔中加抗原，外周 2、4、6 孔加标准阳性血清，1、3、5 孔分别加被检血清。以加样枪吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，加至孔满为止，加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。平皿加盖，待孔中液体吸干后，将平皿倒置，琼脂板放入湿盒中。置15℃～30℃条件下进行反应，逐日观察3d，在强光暗背景下观察沉淀线，并记录结果。

2.4 结果判定

（1）阳性：标准阳性血清孔与抗原孔之间有一条明显致密的沉淀线，受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端在毗邻的被检血清孔处向抗原孔偏弯者。

（2）阴性：被检血清孔与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者。

3 注意事项

（1）制备琼脂板时注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，否则影响抗原抗体在琼脂内的自由扩散。放在普通冰箱中可保存2周左右。

（2）琼脂用打孔器打开孔后，一定要对孔的底部进行封口，以防血清渗漏。

（3）向孔中加血清或抗原时，均以加满而不溢出为度，否则会影响反应效果。

（4）在观察结果时，最好从不同折光角度仔细观察平皿上抗原孔与受检血清孔之间有无沉淀线。

（5）被检血清要求新鲜、清亮透明、无溶血、防止细菌污染、并且避免反复冻融。对冰冻保存的血清融化后，应充分混匀，可以采用上下颠倒的方式混匀。

（6）温度沉淀线的形成有影响，在一定范围内。

（7）标阳血清：能与合格抗原在12h内产生明显致密沉淀线的传贫马血清，做8倍以上的稀释仍保持阳性反应者为宜。小量分装，冻结保存。

（8）配制成的琼脂液，可装瓶中用胶塞盖好，以防水分蒸发，待使用时，现溶化现制板。