寄生虫病LAMP技术研究进展

李 慧，陈 苗，唐 莉，阚珍珍，李文超，顾有方

（安徽科技学院动物科学学院，安徽 凤阳 233100）

近年来随着分子生物学技术的发展，新的核酸扩增技术不断涌现。环介导等温扩增技术，简称LAMP是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰莱样结构的DNA片段的混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱LAMP等温扩增反应体系包含了内外引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和缓冲液。其基本操作过程是将LAMP反应体系 (除 Bst DNA聚合酶)在95℃加热5min后,冷却,再加入8U Bst DNA聚合酶,在63%保温60min,然后在高于80℃的温度下加温2min终止反应。LAMP与以往的核酸扩增方法相比，具有操作简单,快速高效、高特异性、高灵敏度等优点。

寄生虫病在人类传染病中有着非常重要的影响。及时有效的寄生虫病诊断是疾病防治的首要环节。寄生虫病检测手段有病原学、免疫学和分子生物学等。病原学检查是常用的确诊方法,但易导致漏诊或误诊。免疫学检测在敏感性、特异性方面比病原学法有所提高,但却存在交叉反应、不能区分现症患者或既往感染等问题。分子生物学方法在寄生虫病检测中敏感性和特异性比前两者更高,同时也存在着一些不足,如操作繁琐、仪器昂贵、扩增耗时等。因此,迫切需要一种敏感性和特异性高、操作简便快速的方法用于寄生虫感染检测。LAMP是一种崭新的DNA扩增方法,具有简便、快速、特异性强等特点。目前该技术已经应用于胚胎性别鉴定及多种病原体的检测,国外已有用该法检测寄生虫病的相关报道。本文就该技术在寄生虫方面的应用综述如下。

1 华支睾吸虫

华支睾吸虫病在远东地区盛行，是流行地区的一个主要健康问题。感染者如果不治疗，可能会经历严重的并发症，如胆结石形成，化脓性胆管炎，甚至胆管癌。慢性感染引起一些临床表现，包括腹部或上腹不适，疲劳，黄疸，呕吐，发热和腹泻。早期诊断和治疗对预防严重并发症是重要的，因此在诊断资源有限的流行地区，控制华支睾吸虫需要简单可靠的诊断方法。

华支睾吸虫感染是华人、韩国、越南等东亚国家主要的公共卫生问题之一，若不予以治疗，会引起胆管癌。明确的诊断对于成功治疗和预防流行地区的感染是重要的。由于肝吸虫卵和微小肠吸虫之间的形态相似性，粪便检查它们有时会遗漏轻度感染的病例，并可能导致在物种水平上的错误识别。为了克服粪便检查的诊断限制，ELISAs和PCR已经被开发成为一种灵敏而特异的诊断方法，但是它们需要诸如热循环仪和分光光度测定法之类的精密设备，这妨碍了这些技术在低资源地区的广泛使用。LAMP测定可以在等温条件（60～65℃）下进行;因此，简单的水浴或加热器就足以放大特定的DNA。此外，该检测方法可以通过添加荧光染料目测检测DNA扩增。将LAMP分析应用于从韩国的华支睾吸虫病地区采集的人粪便样品。使用Kato-Katz方法和实时PCR作为参考标准，使用显示一致结果的样品，LAMP测定显示出97.1%（95%CI，90.1～99.2） 的灵敏 度和 100%（95%CI，92.9-100）特异性。由于对粪便样品中的C.sinensis DNA进行了灵敏而特异性的检测，LAMP检测方法可以在现场实验室中应用，作为诊断和流行病学调查华支睾吸虫的有力工具。

2 日本血吸虫

日本血吸虫寄生动物门静脉的小血管内，引起的对宿主产生机械损伤，并引起复杂的免疫病理学反应。降低血吸虫病流行程度和感染强度尤其重要，准确的诊断试验在血吸虫病患者管理和控制中起着关键的作用。

诊断是控制血吸虫病的核心。目前可用的诊断方法包括随访化疗。寄生虫学技术（Kato-Katz方法）和抗体检测分析（ELISA和IHA）并不理想。Lier等人报道实时PCR检测在猪模型中检测低强度日本血吸虫感染。随后，这种方法被用于临床试验。这种实时荧光定量PCR检测方法比显微镜方法检测到的阳性粪便样本稍多，但在血清和尿样中一直呈阴性。据我们所知，大多数以PCR为基础的方法都集中在检测粪便中特异性的Schistosoma DNA上，所有这些方法都可以看作是对粪便检查方法的改进，一般来说，血清和尿液样本比粪便样本更容易获得并且在许多人群中被接受，血吸虫DNA将平均分布在患者的整个血清中，因此，血清样本中的血吸虫DNA的检测在现场条件下会更准确。

与PCR不同，LAMP分析不需要通过热循环或通过电泳检测的扩增子进行扩增循环。以前的研究建立了针对SjR2的LAMP分析方法，该方法能够检测到0.08 fg日本血吸虫DNA，比普通PCR分析法灵敏度高104倍。LAMP测定的效用首先在具有非常低的感染强度（EPG=16）的兔子模型中评估。在评估循环介导等温扩增（LAMP）法检测光强度感染或假阴性患者的效用，以及评估患者的化疗有效性实验中，针对高度重复的日本血吸虫反转录转座子SjR2目前的研究表明，LAMP分析是敏感的，具体的和可负担得起的，这将有助于通过有针对性的治疗来减少血吸虫病的传播，特别是那些粪检阴性但可能仍然感染的人。LAMP分析可能为血吸虫病控制和消除策略提供了一个潜在的工具，特别是对于与当前流行的情况相一致的轻度感染的病例。

3 弓形虫

感染弓形虫寄生虫可以通过食用含有组织囊肿的生肉，或被卵囊污染的食物和水来获得。急性感染可导致孕妇经胎盘传播给胎儿，严重损害胎儿，最终导致新生儿畸形，神经损伤，失明或死胎。弓形体病的诊断对控制疾病是重要的。

实验室诊断历来依赖于以下几种方式之一的急性弓形虫感染。例如，寄生虫学和组织学方法是从血液或体液例如组织培养物中分离出速殖子阶段。作为PCR的分子生物学方法是扩增特定的弓形虫基因或DNA片段。作为弓形虫感染的诊断方法，也已经开发了修改的凝集试验，免疫色谱试验和实时PCR法。尽管取得了这些进展，但由于血清学方法费时，并且由于寄生虫抗原制备期间的额外寄生虫物质可能会出现假阳性结果，并且有时不能区分早期感染，所以弓形虫感染的诊断仍不令人满意。虽然最近开发了基于PCR的技术，但是由于反应时间长和设备的昂贵成本而受到限制。因此，我们仍然有必要开发弓形虫的成本效益和快速检测方法。LAMP分析也被用于检测弓形虫，基于人类血液样本的SAG1，SAG2和B1基因诊断弓形体病。最近，AF146527片段（GenBank登录号AF146527）是弓形虫的200～300倍重复的529bp片段，已被用于开发诊断非常敏感和特异性的PCR，LAMP方法被证明是非常具体和灵敏的检测刚地弓形虫在DNA样本和人体血液样本。此外，LAMP方法在检测弓形虫方面比常规PCR等其他方法敏感得多。

4 疟原虫

由于许多分子工具在技术上具有挑战性并需要复杂的设备，因此它们的使用受到限制。已经描述了等温DNA扩增测定，如环介导的等温扩增。这些测定法非常适合于现场使用，因为反应在单一温度下进行，所以它们不需要热循环仪来进行测试。几项研究已经报道了使用LAMP分析疟原虫检测。最近，报道了用LAMP（NINA-LAMP）进行疟疾寄生虫检测的非仪器化核酸扩增。

已经研究了用于LAMP产品读数的比色法，取得了一些成功。MG是传统上用作丝绸，皮革和纸张等材料的染料的有机化合物，MG染料被称为基因组指数扩增反应（GEAR）测定的等温扩增测定。MG-等温扩增分析（LAMP和GEAR）在DNA扩增时产生绿/蓝色，而负样品（无扩增）是无色的，因此不需要特殊的自动阅读器。显示使用MG染料的LAMP和GEAR测定产物的这种视觉评估是可重复的，稳健和一致的。MG-LAMP分析的最有吸引力的特征是它可以潜在地用于筛选大量样品，因为可以使用保持恒定温度的加热块进行分析。研究中表示使用疟原虫特异性MG-LAMP分析证明准确和敏感的疟疾寄生虫检测。

5 隐孢子虫

贾第虫和隐孢子虫是环介导等温扩增（LAMP）是开发的用于DNA扩增的技术，其对DNA污染物的效率和不敏感性优于聚合酶链式反应（PCR）。在奥尔杜省，黑海中部，土耳其共采集了70个水样，包括水龙头，河流，喷泉和井水，并调查了隐孢子虫卵囊的检测。通过显微镜直接筛选隐孢子虫卵囊的免疫荧光检测，然后通过环介导等温扩增（LAMP）和巢式聚合酶链反应（PCR）提取DNA进行分子检测。70个水样中有18个（25.7%）水样被发现为隐孢子虫属。通过免疫荧光试验发现19例（27.1%）LAMP阳性。在任何被调查的水样中都没有产生巢式PCR产物。总共随机选择16个水样，加入10个隐孢子虫卵囊以测试所用方法的效率。所有的样品都被LAMP发现为隐孢子虫DNA的阳性，而在16个检测的加标样品中只有7个（43.75%）的巢式PCR检测为阳性。

6 细粒棘球蚴

由细粒棘球蚴引起的囊状棘球蚴病是导致广泛胃肠疾病的原生动物寄生虫。这些致病原生动物暴发中有90%是通过水发生的。从公共卫生角度来说具有重要的重要性，并且也具有显著的社会经济影响。

对常规的实验室诊断和监测，DNA方法有一个实质性的缺点，即常规PCR的敏感性可能受到粪便样品中存在的抑制因子的严重影响。一种基于环介导等温扩增（LAMP）的有效的监测工具，用于检测在现场收集的阳性犬粪便样品。采用LAMP，PCR和copro-ELISA分析，现场采集的粪便标本阳性率分别为12.6%，1.6%和2.1%。从对照组获得的所有样品都是阴性的。与常规PCR相比，LAMP测定法提供了88.8%的特异性和100%的灵敏度。

7 结语

LAMP方法在临床样品处理中显示出更高的灵敏度和有效率。尽管不同的LAMP检测方法的检测率不同，但LAMP方法在特异性，快速性，灵敏度方面仍然具有优势，并且易于在兽医和医学领域广泛应用。需要做更多的工作来进一步改进LAMP方法寄生虫病的诊断方法，甚至其他病原体。其临床快速，可靠的诊断在发展中国家尤其是基层有重要意义，如能广泛运用将对我国寄生虫防控带来巨大效益。