青藤碱对前成骨细胞增殖、分化的影响及可能的作用机制＊

邹飏 ，李浩 ，尚江荫子 ，双 峰 ，魏志远 ，单记春

青 藤 碱 (9α，13α，14α -7，8-Didehydro-4-hydroxy-3，7-dimethoxy-17-methylmorphinan-6-one，Sinomenine)是从传统中药青风藤（Caulis sinomenii）中提取的一种生物活性成分，具有抗炎、镇痛、免疫抑制、降压、抗心律失常等多种生物活性[1]。临床已有使用的青藤碱类药物有正清风痛宁片、盐酸青藤碱注射液、毛青藤总碱片等制剂，主要用于治疗类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、系统性红斑狼疮等疾病[2]，近年来也有此类药物用于治疗慢性肾炎、抗氧化、抗肿瘤的文献报道[3-7]。

骨保护素（OPG）又称为破骨细胞抑制因子，是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，是目前发现的唯一能直接下调破骨细胞功能的因子。RANKL（细胞核因子受体活化因子配体)是肿瘤坏死因子超家族中的一员，其主要由成骨细胞和骨基质分泌，RANKL能与破骨细胞表面的RANK（细胞核因子受体活化因子）结合，从而刺激破骨细胞分化和成熟、启动破骨细胞的骨质吸收作用，同时抑制破骨细胞凋亡[8，9]。体外方面，青藤碱抑制RANKL诱导的0Cs骨吸收活性并降低相关破骨方面的指标。体内实验显示青藤碱抑制RANKL诱导的NF-κB信号通路，同时促进RANKL诱导的成熟OCs凋亡[10]。但青藤碱对成骨细胞相关的研究并未见报道，就此我们展开青藤碱对成骨细胞方面的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 小鼠成骨细胞系MC3T3E1细胞株（购于中国科学院上海生命科学研究院），胎牛血清（FBS）（公司），DMED 培养液（Hyclone 公司），抗坏血酸 （sigma公司），β-甘油酸磷酸钠 （sigma公司），地塞米松（sigma 公司），青霉素/链霉素（sigma公司），DMSO（sigma公司）盐酸青藤碱（大连美仑生物技术有限公司质量标准：＞98%），MTT（sigma公司），碱性磷酸酶测定试剂盒（可见光比色法）（南京建成），RNA 抽提液（TaKaRa公司），RNA 逆转录试剂盒 （TaKaRa公司），RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司）β-actin（北京中杉金桥生物技术公司），OPG RabbitAnti（北京中杉金桥生物技术公司），RANKLRabbitAnti（北京中杉金桥生物技术公司），Primer（金斯瑞生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养，并常规换液。

1.2.2 分组和给药方法 青藤碱溶解于DMSO，稀释浓度为80mmol/L的溶液过滤4°储存备用，空白对照组浓度为0mmol/L（A组），实验组终浓度为0.25、0.5、1mmol/L（B、C、D 组）。 24h 后更换为诱导培养液 (含10%胎牛血清基础培养液中加入10－8mmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ－甘油磷酸钠)，实验组加入不同浓度青藤碱成骨诱导液，对照组加入不含青藤碱的等量成骨诱导液，每2-3d更换培养液1次，共诱导培养3周。

1.2.3 MTT增殖实验 24孔培养板接种细胞，24h后换液，空白对照组加入0mmol/L青藤碱培养基，实验组分别加 0.25、0.5、1、2、4、8、16mmol/L 含青藤碱的培养基，每种浓度各设3个重复孔。在加入受试药72h后，每孔加入新鲜诱导液200μl和MTT 溶液(5mg/ml用 PBS(pH=7.4)配)20μl，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱孵育4-6h，终止培养，小心吸弃培养上清液，每孔加 150μl DMSO，震荡10min，将待测样品移至96孔板培养板，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，取3孔平均值。

1.2.4 碱性磷酸酶活性测定 细胞按5×103个/ml密度接种于96孔板，24h后换液，空白对照组加入0mmol/L青藤碱培养基，实验组分别加0.25、0.5、1mmol/L含青藤碱的培养基，每种浓度各设3个重复孔。在加入受试药7d后，弃培养液，每孔加入1%Trixon-100，并放入4℃冰箱1h裂解细胞。1h后各孔取50μl细胞裂解液，根据ALP试剂盒的说明在520nm处检测各孔的吸光度值。经公式：（测定孔吸光度值-空白孔吸光度值）（标准孔吸光度值/-空白孔吸光度值）×酚标准品浓度÷待测样本蛋白浓度，得出每孔碱性磷酸酶的含量。

1.2.5 RT-PCR检测OPG RANKL转录水平 将MC3T3-E1细胞种于6孔板内，空白对照组加入0mmol/L青藤碱培养基，实验组分别加0.25、0.5、1mmol/L含青藤碱的培养基，37℃、5%CO2培养24h。Trizol法提取RNA，使用逆转录逆转录（RT reagent Kit TaKaRa）SYBR Green 分 析 法 得 到cDNA。

实时荧光定量PCR反应体系为：。OPG引物序列：上游引物5-AGGAACTGCAGTCCGTGAAG-3；下游引物5-ATTCCACACTTTTGCGTGGC-3；扩增片段长度328bp。RANKL引物序列：上游引物5-AGGCTCATGGTTGGATGTGG-3；下游引物 5-GTCTGTAGGTACGCTTCCCG-3；扩增片段长度259bp。GAPDH引物序列：上游引物5-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3；下游引物 5-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3；扩增片段长度129bp。每组设三个复孔。PCR的循环条件94℃预变性 4min，95℃变性 30s，58℃退火 20s，72℃延伸30s，38 次循环，最后 95℃ 1min，55℃ 1min。 做熔解曲线分析。

1.2.6 Western Blot检测OPG、RANKL蛋白的表达按全蛋白抽提试剂盒说明书提取处理24h后的各组细胞总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。－20℃保存。取各组MC3T3-E1细胞样本70μg，进行SDSPAGE聚丙烯胺凝胶电泳，将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜上，4℃封闭，过夜后按约0.1ml/cm2的量加入封闭液和适量一抗抗体OPG RANKL(1∶1000)摇床摇荡孵育(4℃，过夜)。TBST 漂洗滤膜 4次，每次10min。将膜与HRP结合的二抗(二抗用封闭液稀释1∶2000)室温下摇荡孵育2h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10min。扫描仪扫描胶片，分析软件对扫描所得图像进行分析，将灰度值以 ODOPG/ODβ-actin、ODRANKL/ODβ-actin分别进行OPG、RANKL蛋白分析。

1.3 数据分析 实验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，各组定量检测数据以（x±s）表示，组间比较采用t检验进行处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况 加药72h后加药组均可促进MC3T3-E1成骨细胞增殖，且0.25、0.5mmol/L组OD值显著升高，与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。表明一定浓度的青藤碱对MC3T3-E1成骨细胞有促进增殖作用。

2.2 碱性磷酸酶活性测定 培养第7d时，相对于空白对照组，不同浓度青藤碱诱导培养小鼠前成骨细胞向成骨分化，其中以B组有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 RT-PCR测定成骨细胞基因OPG、RANKL表达 在成骨细胞基因OPG、RANKL的mRNA表达检测中，相对于空白对照组，B、C组浓度成骨细胞内OPGmRNA表达均增高，RANKLmRMA表达均较对照组减低，具有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 Weatern-blot测定成骨细胞基因OPG、RANKL蛋白的表达 在成骨细胞基因OPG、RANKL的蛋白表达检测中，相对于空白对照组，B、C组浓度成骨细胞内OPG蛋白表达均增高，RANKL蛋白表达均较对照组减低，具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

骨是一个代谢活跃的器官，其中骨量的维持是由两个对立统一的系统所控制：破骨细胞所介导的骨吸过程与成骨细胞介导的骨基质合成过程。这两个过程在整个生命周期中都在进行连续的更新与改建。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、相关物质的分泌和骨组织矿化。健康人体内成骨细胞和破骨细胞的数量维持在相对平衡状态以维持正常骨量。一旦破骨细胞的数量与成骨细胞的数量打破了相对平衡，就会导致包括骨质疏松症在内的诸多骨病[11]。

青藤碱是从防己科植物青风藤及毛青藤的干燥藤茎提取的单体生物碱，有研究发现青藤碱可缓解骨破坏进程发展[12，13]。同时，青藤碱能抑制LPS诱导的小鼠急性颅骨骨破坏模型的OCs活化并降低 TNF-α 水平[14，15]，而在胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠血清中，青藤碱能够提高外周血OPG/RANKL比值，提示青藤碱对类风湿性关节炎有骨保护作用[16]。上述研究已表明青藤碱可以通过OPG/RANKL/RANK信号通路影响破骨细胞活性。

OPG作为内源性拮抗RANKL的蛋白为被认为有较强的骨保护功能，其含量的高低提示骨破坏活动的强弱，OPG蛋白及OPGmRNA含量升高提示OPG表达升高，其抑制破骨细胞的分化及激活的能力加强，最终导致骨重吸收活动调低；相应的RANKL蛋白表达及RANKLmRNA含量降低提示RANKL表达降低，其促进破骨细胞分化及激活的能力受抑制，最终导致骨吸收活动受抑制[17，18]。本实验研究发现，含有低中浓度青藤碱诱导液培养的前成骨细胞内，其OPG蛋白较对照升高，RANKL蛋白含量较对照组减低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；此外，这两组含青藤碱药物组较对照及其他药物组可增加OPGmRNA、减低RANKLmRNA的表达，差异有统计学意义 （P＜0.05）。上述研究结果提示：青藤碱可刺激成骨细胞分泌OPG增多，并且抑制成骨细胞分泌RANKL，一方面起骨保护作用，另一方面结合其抑制破骨活性的效果，使青藤碱在以后有望成为一种抗骨质疏松的作用药物。

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