儿童急性淋巴细胞白血病复发相关基因突变的研究进展

曾 星综述，于 洁审校（重庆医科大学附属儿童医院，重庆400013）

儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤之一。随着大剂量联合化疗方案的不断改进，对危险因素的认识不断深入，基于危险因素的分层化疗的实施，以及支持治疗保障的提高，儿童ALL治疗效果得到了显著提高。发达国家儿童ALL的5年生存率可达90%以上，但仍有8%～20%患儿复发。ALL患儿首次复发后即使采取积极的增强化疗及异基因造血干细胞移植治疗，仅有少数患儿可以得到长期生存[1]。疾病复发已成为制约儿童ALL预后的关键难题。随着高通量基因检测技术的广泛应用，多种与白血病复发相关的基因变异被相继发现，主要涉及淋系分化调控、表观遗传修饰、核酸代谢、细胞周期调控等多种重要信号途径，这些基因异常增强了白血病细胞的增殖和抗凋亡能力，对关键化疗药物产生耐药，进而导致复发。本文就近年来发现的与儿童ALL复发相关的基因进行综述。

1 与淋系分化调控相关基因

1.1 IKZF1基因 IKZF1基因位于7p12，其编码的蛋白为Ikaros，是一种重要的转录因子，其可以通过N端的DNA结合区域与靶基因的特异序列结合，从而激活或抑制靶基因的表达，参与早期淋巴细胞分化、成熟[2]。IKZF1基因缺失导致Ikaros单倍体不足或显性负相亚型（DN型）过度表达，是导致儿童ALL早期复发的重要原因之一。IKZF1基因缺失在BCR-ABL阳性的B-ALL患儿中最为常见，且BCR-ABL阳性患儿若合并IKZF1缺失，则表现出对伊马替尼不敏感，在BCR-ABL阴性ALL患儿中也表现为酪氨酸激酶持续激活，呈类BCRABL样特征，对化疗反应差，难以达到完全缓解，且复发风险高[3-4]。在欧洲癌症研究与治疗组织的多中心研究中，对1 223例BCR-ABL阴性儿童进行测序分析，其中179例（14.6%）患儿检测到IKZF1缺失，且以B-ALL患儿最为常见，临床特征为年长、白细胞水平高、对化疗反应差、微小残留病（MRD）水平高、复发风险高，且多与iAMP21、MLL重排、低倍体等已知预后不良因素明显相关，多因素COX回归分析显示，IKZF1缺失是儿童ALL的一项独立预后因素[5]。在BCR-ABL阳性ALL患儿中，IKZF1基因缺失率超过70%[6-7]，因为BCR-ABL阳性本身即是已知的对预后不良的重要危险因素。且自20世纪中叶以来，酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的应用使得BCR-ABL阳性患儿预后得到明显改善。为避免TKIs的应用影响IKZF1基因缺失对预后的判断，VAN[6]等研究应用TIKs治疗，结果显示，在BCR-ABL阳性ALL患儿中，含有IKZF1基因缺失患儿仍预后不良，且多在早期复发，其是1项独立的预后不良因素，可作为分层化疗的依据。

1.2 酪氨酸蛋白激酶-2（JAK2）与细胞因子受体样因子2（CRLF2）基因

1.2.1 JAK基因 JAK基因是一类非受体酪氨酸激酶家族，包括 JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK1，可被细胞因子受体激活，活化的JAK催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化，进而磷酸化激活信号转导及转导激活因子（STAT），磷酸化后的STAT转运进入细胞核内，参与转录调节靶基因的表达，即JAK-STAT信号转导通路[8]。JAK-STAT信号通路参与多种生理调节过程，涉及细胞的生长、分化，造血及免疫功能等，JAK突变导致JAKSTAT信号通路持续激活，导致造血细胞的过度增殖、分化受抑，是导致白血病发生、复发的主要原因之一[9]。MULLIGHAN等[10]对187例BCR-ABL阴性高危ALL患儿进行JAK基因检测，发现约10.7%的患儿存在JAK基因突变，JAK突变阳性患儿4年累积复发率为33.3%，高于JAK突变阴性患儿的复发率23.2%，提示JAK突变与复发相关。STEEGHS等[11]对461例B-ALL患儿分析发现，JAK2畸变组预后较无JAK2畸变组差，16例含有JAK2突变：6例复发，9例有MRD监测，其中4例在D19/33有较高的MRD水平，且均复发；剩余5例中MRD呈低水平，但其中2例在诊断后2.4年内复发，且这2例在初诊时因年龄大于10岁及初诊时白细胞数大于50而归于高危组。以上研究均提示JAK2突变与复发相关且预后不良。

1.2.2 CRLF2基因 CRLF2基因与白细胞介素-7受体α形成异二聚体受体，是一种细胞因子受体，与配体TSLP结合后可激活下游JAK-STAT信号通路[3]。CRLF2基因重排形成P2RY8/CRLF2和IGH/CRLF2，可导致CRLF2蛋白过度表达，与JAK2基因突变共同作用使JAK-STAT信号通路持续活化，影响细胞增殖、分化，与白血病复发及不良预后相关[12]。HARVEY等[13]对207例高危B-ALL患儿的基因检测发现，29例（14%）患儿CRLF2呈高表达，其中18例为IGH/CRLF2，10例为P2RY8/CRLF2，1例同时含有以上2种CRLF2重排，且CRLF2高表达患儿4年无复发生存率（EFS）为35.3%，显著低于无CRLF2重排的患儿（71.3%），差异有统计学意义（P＜0.05）。多项研究表明，CRLF2改变常与JAK基因突变及IKZF1相伴发生，三者共同作用导致JAKSTAT通路持续激活，影响正常淋巴细胞发育，与ALL复发及不良预后相关[3，14]。

2 与表观遗传学修饰相关基因

2.1 CREBBP基因 CREBBP基因编码的环腺苷酸反应元件结合蛋白是一种转录辅激活因子，含有组蛋白乙酰转移酶（HAT）结构域，具有HAT活性。CREBBP基因突变或缺失导致其组蛋白乙酰化能力减弱和靶基因转录受抑制，从而影响CREBBP对靶基因（即糖皮质激素受体反应相关基因）的转录调控能力，进而导致激素耐药、疾病复发[15]。CREBBP的纯合缺失在小鼠模型中表现为严重的发育异常，CREBBP+/-的小鼠则表现为B细胞发育缺陷，其血液肿瘤的发病率也显著增加，约20%复发ALL患儿中可见CREBBP基因的突变或缺失，且以高2倍体复发患儿最为常见[16]。INTHAL等[16]对341例ALL患儿进行基因测序分析，71例ALL患儿复发，其中13例（18.3%）携带CREBBP基因突变，而在缓解患儿中仅0.7%检出突变，提示CREBBP基因与复发相关。INTHAL等[16]检测1组含有野生型或CREBBP突变型的T淋巴细胞株对地塞米松和乙酰化酶抑制剂（伏立诺他）的反应，发现大部分细胞对地塞米松耐药，而对伏立诺他（有效浓度IC50小于1 μm）敏感，可见CREBBP突变削弱了组蛋白乙酰化作用，进而影响糖皮质激素受体反应相关基因的转录、表达，导致对糖皮质激素耐药，而去乙酰化酶抑制剂伏立诺他对部分激素耐药的ALL患儿有效，更进一步佐证了该观点。

2.2 混合谱系白血病基因（MLL） MLL也称KMT2A，位于11q23，其编码蛋白质是一个由3 969个氨基酸组成的多结构域蛋白，各结构域具有不同功能，其中C端末端的SET结构域是主要的催化结构域，也是大多数组蛋白甲基转移酶都具有保守催化结构域[17]及组蛋白H3K4甲基化酶功能[18]。大部分MLL易位重排后，其编码的融合蛋白保留了N端的AT钩结构域、SNL结构域和RD结构域，而C端的PHD结构域、TA结构域和SET结构域丢失。因此，MLL融合蛋白失去了组蛋白甲基化能力，进而影响其对下游靶基因（HOX基因家族）转录调节[18]。有研究表明，MLL重排常见于婴儿ALL，其预后极差，5年EFS仅为20%～40%，容易早期复发，即使采取高强度化疗及移植仍不能改善预后[19-20]。MLL重排患儿其甲基化程度与复发风险呈正相关，而去甲基化药物如地西他滨等对有MLL重排的白血病细胞治疗有效，提示MLL重排导致组蛋白甲基化异常与ALL患儿复发相关[21]。

2.3 糖皮质激素受体基因（NR3C1）与B细胞易位基因1（BTG1） 糖皮质激素作为最重要的化疗药物之一，通过与糖皮质激素受体GR结合，形成GR-GC复合物进入细胞核内，与靶基因能结合有效的介导白血病细胞凋亡，其耐药与白血病复发密切相关。NR3C1基因编码糖皮质激素受体，该基因缺失使糖皮质激素受体表达下降，机体对糖皮质激素反应降低，进而导致激素耐药、复发。虽有研究报道，NR3C1基因缺失为复发特异性基因，但该基因突变多发生在体外细胞株，在患者标本中很少发现，提示其不是糖皮质激素耐药的主要机制[22]。有研究表明，10%～14%的复发患儿可检出BTG1和TBL1XR1缺失，且与糖皮质激素耐药相关[23]。BTG1蛋白是糖皮质激素受体的辅激活物，可与精氨酸甲基转移酶（PRMT1）形成BTG1/PRMT1复合体，结合至糖皮质激素受体基因启动子区，调控糖皮质激素受体的表达。BTG-1基因突变或缺失导致BTG-1蛋白生成减少，可减少激素受体的表达而导致糖皮质激素耐药，上调BTG-1基因的表达则可以重建药物敏感性。因此，BTG1基因突变与激素耐药相关，进而导致复发[24]。

3 与核酸代谢系相关基因

3.1 NT5C2基因 MEYER等[25]对10例复发B-ALL患儿进行转录组测序发现，2例患儿包含有同一基因NT5C2突变，对另外61例复发的ALL患儿进行全外显子测序发现，5例患儿包含NT5C2突变。在临床表现上，所有包含NT5C2基因突变的患儿均在早期复发（初诊后36个月内复发）。TZONEVA等[26]研究发现，3%（1/35）的B-ALL复发患儿及19%（20/103）的T-ALL复发患儿含有NT5C2基因突变，且携带有该突变对的患儿对核苷类似物化疗耐药。以上研究均提示，NT5C2基因突变与复发相关。NT5C2基因编码5'-核苷酸酶（cN-Ⅱ）蛋白，分布于细胞质中，参与调节和稳定核苷酸库，维持细胞的正常生理功能[27]。cN-Ⅱ能从5'端水解单磷酸核苷酸[次黄嘌呤核苷酸和单磷酸腺苷（AMP）]，同时对单磷酸化核酸如次黄嘌呤、抗肿瘤核苷类似物具有去磷酸化作用，参与核苷类似物在细胞内的代谢过程[28]。6-巯嘌呤（6-MP）、6-巯鸟嘌呤等核苷类似物进入细胞内必须经激酶磷酸化，才能进一步生成活性代谢产物发挥细胞毒性，但是磷酸化的核苷类似物可能作为cN-Ⅱ的底物被降解，从而降低其活性代谢产物的浓度。NT5C2突变患儿使cN-Ⅱ去磷酸化活性增强，导致6-MP及6-巯鸟嘌呤耐药，是导致白血病复发的重要原因之一[29]。

3.2 磷酸核糖焦磷酸合成酶1（PRPS1）基因 LI等[30]对16对初发、缓解、复发的B-ALL患儿进行全外显子测序发现，PRPS1突变为复发特征性突变，且所有突变患儿均早期复发。PRPS1基因编码磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRS），是嘌呤生物合成中第一个限速酶，可催化三磷酸腺苷和5-磷酸核糖的反应，生成AMP和5-磷酸核糖-l-焦磷酸。在正常细胞中，由于反馈抑制作用，PRPS1处于较低水平。在PRPS1突变患儿中，该基因突变使核苷酸对PRPS1活性的负反馈抑制作用减弱，导致嘌呤从头合成持续激活，产生次黄嘌呤堆积，从而竞争性抑制6-MP转化为具有细胞毒性的巯鸟嘌呤核苷酸，导致其耐药[31]。对编码嘌呤从头合成特异性酶的基因进行基因敲除，或使用抑制嘌呤从头合成代谢药物（如洛美曲索）[32]，均可逆转含有PRPS1基因突变的细胞的巯嘌呤耐药。

4 与细胞周期相关基因

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A/2B（CDKN2A/B）位于9p21，是属于细胞周期依赖性酶抑制因子基因家族，CDKN2A编码2种蛋白质：一是细胞周期依赖性激酶抑制蛋白P16（p16INK4a），二为其可变阅读框基因产物 P14（P14ARF）[32]。CDKN2B 编码另一个细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白 P15（p15INK4B）[33]。正常情况下，p15INK4B/p16INK4a与细胞周期蛋白竞争性结合细胞周期蛋白依赖蛋白激酶（CDK4/6），抑制CDK4/6激酶活性，而使视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）无法磷酸化，阻止细胞进入S期及DNA的合成启动，继而抑制细胞增殖；同时，高磷酸化的pRb可诱导p15INK4B/p16INK4a表达，进而反馈性抑制Rb蛋白磷酸化。因此，p16、p15在细胞周期调节途径p15INK4B/p16INK4a-CDK4/6-pRb-E2F中起负反馈调节作用，二者异常则会引发细胞增殖失控，导致肿瘤发生。CDKN2A编码的另一种蛋白P14ARF可与E3泛素蛋白连接酶（mdm2）结合，从而减弱mdm2介导的P53降解作用。当CDKN2A突变导致P14AR不能和mdm2结合引发mdm2降解P53，从而诱发肿瘤。CDKN2A基因缺失、突变、甲基化已证明与多种造血系统肿瘤相关，其中CDKN2A基因缺失最常见[34]。XU等[35]研究发现，215例成人B-ALL中，CDKN2A缺失率为28.4%，而复发患者中其缺失显著升高，为44.6%（P=0.006），可见CDKN2A基因缺失与ALL复发显著相关，而CDKN2A/B在儿童白血病中的作用仍存有争议。MAUDE等[9]对204例纳入ALL-REZ BMF2002方案化疗的患儿进行测序分析发现，超过90%的复发ALL患儿含有CDKN2A/B基因缺失，复发多为早期或极早期复发，且二次复发的风险较高，但其潜在当量因子和pOS无显著差异，通过MRD评价其对化疗的反应来看，CDKN2A/B基因缺失患儿对化疗敏感，容易达到二次缓解。因此，即使CDKN2A/B基因缺失与早期复发相关，但其通过化疗后容易再次缓解，CDKN2A基因突变与否都与其最终预后无显著相关。

5 小 结

综上所述，儿童ALL的复发受到多种基因功能缺陷影响，涉及淋系分化调控、表观遗传学修饰、核酸代谢、细胞周期调控等多个途径，各基因之间并非完全独立，他们相互作用、叠加，其机制异常复杂，目前尚无统一的认识。对复发分子机制的深入认识，有助于研究人员更为精准地进行危险度分层、判断预后，并为分子靶向药物的研发及应用提供依据。