染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用综述

张文玲，刘晓婷，张立文，王成彬

解放军总医院 医学检验中心，北京 100853

自20世纪 60年代后期染色体条带技术开展以来，染色体核型分析作为产前诊断的“金标准”被广泛应用于临床，但其只能检测出染色体片段＞5 Mb的异常，无法发现染色体上微小片段(小于3 ～ 5 Mb)的缺失及重复[1]，无法准确定位额外小标记染色体(small supernumerary marker chromosomes，sSMC)的来源；而且染色体核型分析需要进行细胞培养，报告周期长(10 ～ 14 d)。染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)是一项新兴的染色体分析技术，能够检测出大于1 kb的拷贝数变异(copy number variation，CNV)微缺失/微重复，故而被称为“分子核型”[2]。与染色体核型分析相比，CMA具有更好的分辨率、更高的自动化程度和更快的检测周期，弥补了染色体核型分析的不足。2013年美国妇产科医师学会建议当胎儿存在一个或多个系统超声异常并需要进行侵入性产前诊断时应用CMA技术[3]。本文对CMA的检测原理、在产前诊断中的应用、CMA结果解读与遗传咨询、CMA的优势与局限性等进行系统综述，为该领域科技人员提供参考。

1 CMA的检测原理

根据芯片设计与检测原理的不同，CMA技术可分为基于微阵列的比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)技术和单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)微阵列技术。

aCGH是在比较基因组杂交技术的基础上发展起来的芯片技术，其原理是分别用不同颜色的荧光(如绿色的Cy3荧光素和红色的Cy5荧光素)标记待测样品与健康人参照样品全基因组DNA等比例混合后，与载体上固定好的微阵列序列竞争性杂交，通过计算机软件分析比较待测样品和参照样品两种荧光强度，待测样品中的缺失区域会产生更强烈的Cy5信号(红色)，而重复区域会产生更强烈的Cy3信号(绿色)，从而确定待测样品全基因组水平上拷贝数变化情况。aCGH的分辨率取决于所用探针的数量和类型以及它们在整个基因组中的分布。最初用于aCGH的探针来源于细菌人工染色体克隆，通常为100 ～ 150 kb，现多被寡核苷酸探针(25 ～ 75 bp)取代，因寡核苷酸探针能提供更高的分辨率与更好的重现性[2]。

与aCGH技术不同，SNP微阵列技术只需标记待测样品的基因组DNA并与SNP微阵列杂交。给定SNP的A和B等位基因用不同的荧光染料标记，测量待测样品的绝对荧光强度，并通过与正常参照样品数据库的荧光强度(计算机模拟)比较来确定拷贝数变化。临床应用的大多数SNP阵列是包含SNP探针与拷贝数探针的杂合阵列。与aCGH相比，SNP阵列具有检测等位基因失衡的优势，除了能检测CNV外，SNP微阵列技术还能够检测出大多数的单亲二倍体与三倍体[2]。

目前大多数临床使用的CMA平台具有“靶向性”，可以检测靶向区域的20 ～ 50 kb的不平衡和与非靶向区域中100 ～250 kb的不平衡[4]。这种设计减少了对临床意义不明确的拷贝数变异(variant of uncertain significance，VOUS)的检出，同时保持平台高效检测亚显微不平衡染色体重排，以及与已知基因组疾病相关的缺失与重复。然而，部分学者主张使用全基因组阵列以提高灵敏度。全基因组阵列在发现新的亚显微综合征中作用显著，同时全基因组阵列将检测到更多VOUS。申请CMA检测时，临床医师应了解当前使用的各种CMA平台及其局限性。

2 CMA在产前诊断中的应用

目前，CMA的临床应用主要有：1)儿童复杂、罕见遗传病在排除染色体病、代谢病及脆性X综合征之后的全基因组CNV检测。2)对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠产物的遗传学检测。3)对产前诊断中核型分析结果异常但无法确认异常片段的来源和性质者进行DNA水平的更精细分析。4)对产前超声检查异常而染色体核型分析结果正常的胎儿进一步行遗传学检测。在产前诊断领域中，CMA主要应用于后两种[5]。

2.1 明确核型分析异常片段的来源和性质 在产前诊断中，sSMC的发生率为0.075%[6]。sSMC的表型效应与其来源、片段大小以及是否含有重要的功能基因和调控基因等相关，而染色体核型分析不能确定sSMC的来源和性质。CMA技术能够在分子水平精确定位sSMC片段来源，确定包含的基因及其功能，对染色体疾病基因型-表型关系的诊断具有重大的应用价值[7-9]。此外，染色体易位的形成往往伴随着一些微小片段的丢失或重复，受检测水平的限制，传统细胞遗传学诊断出的平衡易位核型很有可能隐藏着众多的微小不平衡。Schluth-Bolard等[10]发现，约40%的染色体平衡易位通过CMA进一步检测，可能为不平衡易位。对于产前诊断中染色体核型检查发现的胎儿染色体平衡易位，CMA技术可以进一步明确该易位是否打断编码基因、是否在断裂点附近存在小片段的缺失或重复，这些都有助于明确胎儿染色体平衡易位是否具有病理性质，有利于遗传咨询及胎儿预后评估[11]。

2.2 对产前超声检查异常而染色体核型分析正常的胎儿进一步检测 CMA用于产前诊断染色体异常时表现出优异的诊断性能(灵敏度96.2%，特异性100.0%)[12]。与染色体核型分析相比，CMA能够提供超过常规核型分析的诊断信息，显著提高胎儿染色体异常的检测成功率和诊断率[13-14]，尤其当超声检查发现胎儿结构异常时，产前CMA分析最有效[3]。Hillman等[15]的系统评价发现，常规核型分析“正常”，不考虑诊断指征时，CMA可以检测到3.6%的基因组失衡；当诊断指征是超声结构畸形时，检测到的基因组失衡将增加到5.2%。Hillman等[16]的前瞻性队列研究证实，当胎儿超声检查异常时，与常规核型分析相比，CMA提高了4.1%的异常检出率。胡婷等[17]对477例已排除常见染色体非整倍体的超声异常胎儿羊水样本进行CMA检测，检出致病性CNV 24例，检出率为5.03%。其中62例多系统结构异常胎儿中检出致病性CNV 6例，检出率为9.68%；147例单系统结构异常胎儿中检出致病性CNV 11例，检出率为7.48%；268例超声软指标异常胎儿中检出致病性CNV 7例，检出率为2.61%，多系统结构异常胎儿具有更高的CNV检出率。De Wit等[18]的文献系统评价也显示，超声异常限于一个解剖系统的胎儿携带致病性CNV的概率为3.1% ～ 7.9%，这取决于受影响的解剖系统；对于多发性超声异常胎儿，这一概率增至9.1%。多项研究均证实CMA在不同表现的胎儿超声异常中的诊断和预后价值，如生长发育迟缓[19]、NT增厚[20-21]、心脏异常[22-25]、神经系统异常[26-27]等。国内外均已提出专家共识，建议当胎儿存在一个或多个超声异常并需要进行侵入性产前诊断时，推荐使用CMA；对于胎儿核型分析结果不能确定染色体畸变情况时，建议采用CMA技术进一步分析以明确诊断[3,5]。

3 CMA结果的解读

2011年美国医学遗传学会发布了CNV解释指南，建议采用5级报告系统，即致病性的、可能致病性的、不确定的、可能良性的或良性的CNV[28]。CMA报告应提供以下与报告的CNV相关的特定信息：细胞遗传学位置(染色体和条带)；CNV类别(即缺失或重复)及机制(如果已知)；CNV大小与基因组构建的坐标(即hg19)；5级制度界定的重要声明(包括证据和参考文献)；所涉及的基因(如果CNV与已知综合征相关，则列出与病症相关的基因；其他情况下列出所有参考序列基因)；适当的临床随访建议。

确定CNV的临床意义可以参考已发表的病例报道、病例对照分析、病例综述等资料，查阅共享的公共数据库，如DGV数 据 库(http：//dgv.tcag.ca)、DECIPHER数 据 库(http：//decipher.sanger.ac.uk)、OMIM数 据 库(http：//www.omim.org)、UCSC数据库(http：//genome.ucsc.edu)、ISCA数据库(https：//www.clinicalgenome.org)和PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)等，数据库的不断完善对规范和明确CMA结果的解释及遗传咨询起着重要作用。

虽然CMA具有检测1 kb碱基范围内CNV的潜力，但在产前检查中，大多数临床实验室多报告已被充分验证且在已知致病区域中的CNV。在这些临床重要区域之外的CNV通常仅在满足特定标准时才报告。这些标准因实验室而异，但通常包括大小阈值(＞1 ～ 3 Mb)以及CNV含有OMIM基因等要求。

4 CMA产前诊断的遗传咨询

随着医学基础研究的深入，对CNV的临床解释可能发生改变，原本认为良性的CNV可能在一定时间后被认为是致病性的。类似这样的问题，在产前诊断中很可能导致法律纠纷。因此，CMA检测前患者充分的知情同意与检测后CMA结果的咨询解释不可或缺。临床CMA的报告应由具有适当专业培训和认证的人员进行，该测试的理想实验室设置是具有细胞遗传学和分子遗传学专业检测能力的实验室[28]。

在进行CMA检测前与患者讨论非常重要。可以与患者讨论检测目的、方法学、获取样本的选项(即羊膜穿刺术、绒毛膜取样、血清或组织)、不完全外显率和变异表达率的不可预测性以及检测的局限性等[29]。除可能检测到VOUS外，CMA还可能检测到与成人时期发病的疾病相关的遗传异常，某些类型的阵列还可以识别血缘关系(血亲关系或乱伦)和非亲缘关系，这些与医学伦理相关的问题需要给予关注。报告的信息类型和数量取决于所使用的阵列类型以及执行分析的实验室策略。在一项评估产前CMA知情决策水平以及影响决策因素的调查中发现，只有49%的医师作出了明智的决定，“信息越多越好”成为影响被调查者接受产前CMA决定的主导因素[30]。因此，在患者接受CMA检测之前，遗传咨询和知情同意是必不可少的。

同样，检测后CMA结果的咨询解释也极为重要，非预期诊断的报告并不少见。Gijsbers等[31]认为，随着CMA分辨率越来越高，实验室程序不断改善，将有越来越多VOUS被发现。CMA在临床应用中所面临的最大困难之一是临床医师如何对VOUS进行遗传咨询。即使CMA检测已包括知情同意过程，许多患者依旧对结果不确定的可能性缺乏足够了解，并且在收到异常结果后需要决定是否继续妊娠时感到非常痛苦[32]。在对193名产前遗传咨询师进行的一项调查中，当CMA结果发现VOUS时，只有59%的医师能够轻松提供遗传咨询，只有43%的医师能够很好地帮助患者做出终止妊娠的决定[33]。由于越来越多地使用产前微阵列检测，不确定的检查结果越发常见，因此需要更详细的检测前后咨询，以及为医师提供更多的教育资源，以便他们能够更好地服务患者，确保患者可以做出恰当的决定。

5 CMA在产前诊断应用中的临床指南

美国妇产科医师学会于2009年首次提出在产前诊断中应用CMA技术，建议常规核型分析仍然是产前诊断的主要细胞遗传学工具，CMA目前不能代替传统细胞遗传学在产前诊断中的应用。在胎儿结构异常情况下可以进行CMA检测。在传统染色体核型正常且胎儿没有结构畸形的情况下，也可向已接受产前诊断风险并了解VOUS可能性的妇女提供CMA[1]。美国医学遗传学会建议对CMA检测到染色体失衡情况的后续分析，应包括患者的细胞遗传学或荧光原位杂交研究、亲本评估以及临床遗传评估和咨询等[34]。

美国妇产科医师学会和美国医学遗传学会在2013年更新了CMA在产前诊断中应用的指南，建议无论母亲的年龄或其他风险因素如何，都应通过筛查或诊断检测为孕妇提供非整倍性的产前评估。当胎儿结构异常和(或)死产的情况下进行遗传分析时，可以使用CMA代替常规核型分析。在胎儿结构正常的情况下进行侵入性产前诊断时，可以进行CMA或常规核型分析。由于CMA发现的大多数致病性CNV与母亲年龄增加无关，所以检测不应局限于35岁或以上的女性[3,35]。2011年加拿大妇产科学会和加拿大医学遗传协会在产前诊断中应用CMA技术的规范中联合指出，CMA不建议用于结构性染色体异常低风险的妊娠(如高龄孕妇、母体血清学筛查阳性、先前的三体性或胎儿超声“软指标”异常)，但在超声或磁共振成像检测到胎儿结构异常的情况下可以使用CMA。如果快速非整倍性筛查是阴性的并且确保适当的检测周期，则可以CMA代替核型分析。任何有资格进行CMA检测的孕妇，在检测之前都应该先接受医学遗传学家的咨询，以便详细了解CMA分析的好处、局限性、可能的 结果和解释CNV的困难[36]。2017年更新后的规范建议当检测到多系统胎儿畸形或颈部半透明NT≥3.5 mm时，应在正常快速非整倍性筛查后提供CMA。为了尽量减少不确定结果的报告，建议产前诊断不常规报告小于500 kb缺失或1 Mb重复的VOUS[37]。

6 CMA在产前诊断应用中优势与局限性

美国医学遗传学会指出，与核型分析相比CMA的优势在于：1)可以分析更广泛的标本类型，不需要组织培养(CMA同样适用于未培养的绒毛、羊水、胎儿组织和血液，包括储存的样本和石蜡块)。2)分辨率更高，可以鉴定传统染色体核型未发现的微缺失和微重复。3)检测平台可定制，可以根据特定要求而在感兴趣的区域增加探针密度，调整检测范围。4)更直观准确地描述核型上发现的结果，精准定位异常片段来源，客观数据的解释，而不是对带强度的主观视觉评估，对基因型-表型关系及预后给予更准确诊断，从而利于遗传咨询[35]。

CMA也存在自身的局限性：1)不能有效测出基因组平衡的染色体易位及倒位。2)低水平嵌合的检出依赖于平台种类、样本类型、DNA质量、数据质量以及不平衡的大小等因素。3)可能无法阐明遗传失衡的染色体机制，缺乏关于CNV机制的信息(核型将在大多数情况下提供此信息，如不平衡易位，标记染色体等)。4)可能无法检测或难以检测到四倍体或其他多倍体。5)无法检测到平台上未覆盖基因组区域的CNV。6)受芯片设计所限，不可能检测出与特定综合征相关的所有相关位点异常，阴性CMA结果不能100%排除染色体疾病。7)并非所有的CNV都是致病性的，CMA可能会检测到VOUS。

7 结语

与传统染色体核型分析相比，CMA提供了更高的分辨率，可以有效诊断额外6%的先天性异常胎儿的染色体微缺失和微重复[38]。因为不需要经过细胞培养，CMA具有更快的检测周期，这个优点在宫内胎儿死亡、自发性流产和妊娠晚期羊膜穿刺术中尤其明显。尽管VOUS的检出会给CMA的咨询解释带来挑战，但随着更多大规模前瞻性队列研究和CMA在产前诊断中的应用，CNV数据库将不断完善，更多染色体病基因型-表型关系将不断被阐明，CMA在产前诊断领域将展现更大的应用价值。