不同固定液在细胞蜡块技术中的应用

王敏，虞继红，贺吉，余波

脱落细胞学检查是病理诊断常规方法之一，常规的细胞学涂片常因细胞量少、细胞发生变性及涂片厚薄不均等因素影响，导致细胞学诊断的阳性率较低，易发生漏诊；且仅根据涂片上有限的肿瘤细胞，不易判断肿瘤细胞的来源，也无法进行一些后续的检测手段，如免疫组化及基因检测等。然而将临床上最常见的脱落细胞学检查标本胸腹水制作成细胞蜡块，可明显提高细胞病理诊断的敏感性和特异性，而且对于部分获取病理组织困难者意义较大。细胞蜡块制作方法多种，所用固定液也多种，为寻找制作细胞蜡块最佳的固定液，本文采用3种病理科常用的固定液，对同一细胞涂片阳性的浆膜腔液体进行细胞蜡块制作，发现12%中性甲醛固定效果最佳。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 收集2018年1—6月宁波市北仑区人民医院病理科肿瘤性胸腹水10例，细胞学涂片诊断明确见到癌细胞。按需要选择 CK（pan）、CK7、CEA、TTF-1、p63、CD56及Syn等抗体，一抗试剂为福州迈新公司，二抗及显色液为DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞蜡块制备方法 （1）临床送检新鲜胸腹水，通过常规细胞学涂片诊断见到癌细胞的病例，用标1、2、3三个50m l尖底离心管各取约40 m l胸水，离心速度3 000 r/m in，离心10 m in，弃上清，若细胞量过少，可以采取多次离心弃上清，保留沉淀物。若胸腹水为血性标本，建议用冰醋酸酒精液（25m l酒精+10m l冰醋酸+65 m l水）去除红细胞；具体操作方法如下：先将胸腹水置于离心管中进行首次离心，弃去上清，再将冰醋酸酒精液置入离心管中，混匀，进行再次离心，弃上清，随后向离心管中加入相应的固定液。（2）1管加入12%中性甲醛、2管加入95%乙醇、3管中加入甲醇各10 m l。（3）震荡，静置1h左右，再离心，弃上清。（4）用吸管将离心管底部的细胞吸取到显微镜擦镜纸上，包好，放入盛有12%中性甲醛标本盒中1 h，与常规组织取材后，一起放入自动脱水机中进行组织处理，待组织处理结束，取出组织块，进行常规石蜡包埋，制作成细胞蜡块。

1.2.2 切片与烤片 将细胞蜡块放入冰箱冷冻室放置5～10 min，进行常规切片数张，切片厚度为4 m，置入65℃烤箱烤片1.5 h。

1.2.3 HE染色和免疫组织化学染色一张切片进行常规HE染色，其余数张切片根据不同需要进行相应的免疫组织化学抗体染色，根据一抗需要选择不同的修复液，按照一抗及二抗试剂说明书进行EnVision染色法，DAB显色完成后进行苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明中性树胶封固，显微镜下观察。

2 结果

2.1 显微镜下观察HE切片结果 采用12%中性甲醛固定的细胞块，细胞排列方式明显可见，细胞形态完好，细胞轮廓清晰，胞核明显可见，肿瘤细胞与周围正常间皮细胞、组织细胞形态学形成鲜明对比，异型肿瘤细胞核仁较明显，背景干净，染色鲜艳（封四彩图6）；采用95%乙醇、甲醇固定的HE切片染色效果相似，细胞排列方式不易辨认，细胞形态稍有退变，细胞轮廓欠清晰，胞浆淡染，空泡化明显，核保存欠佳，部分核体积增大，部分核固缩，染色不鲜艳（封四彩图7）。

2.2 免疫组化标记结果 3种固定液固定的浆膜腔积液在相同肿瘤中均呈阳性，但12%中性甲醛固定的细胞蜡块的免疫标记染色效果最好，标记清晰，背景干净（封四彩图8～9）；95%乙醇、甲醇固定液固定的细胞蜡块免疫标记染色效果欠佳，标记稍减弱（封四彩图10～11）。

3 讨论

目前针对临床上送检的浆膜腔积液，处理方法通常为2种，一种是采用细胞学涂片，其缺点是细胞采集量少，且涂片易厚薄不均，制片质量与人员的技术水平关系密切，易受多种因素影响，从而影响病理诊断；另一种是采用液基细胞学制片技术，此方法改善了细胞学制片质量，但标本失去了细胞排列方式和背景细胞，对可疑和高分化癌细胞以及反应性间皮细胞和间皮瘤不易鉴别[1]，且成本较高，检查费用昂贵，在许多小型医院无法开展。而细胞蜡块技术的应用，使细胞有组织学形态，保存了细胞的排列方式，且细胞蜡块可进行多次切片，用于其他多种项目的检测，如特殊染色，免疫组织化学染色等，进一步提高了细胞学诊断的阳性率，还可以判断细胞的来源、分型及评估患者预后[2]。

临床上细胞蜡块制作方法有多种[3-4]，但是对于不同固定液对浆膜腔积液制作细胞蜡块效果影响的文章较少见。本文应用临床上最常见的3种固定液（12%中性甲醛，95%乙醇、甲醇）对浆膜腔积液细胞制作为细胞蜡块时进行固定，观察此3种固定液对细胞蜡块HE染色及免疫组织化学染色效果的影响.实验结果得出12%中性甲醛固定液的固定效果最好，HE染色鲜艳，细胞形态完好，免疫组织化学染色结果清晰，易判；而95%乙醇和甲醇的固定效果欠佳，HE染色颜色不鲜艳，细胞形态发生改变，细胞空泡化明显，部分核固缩，部分核体积增大，免疫组织化学染色抗体标记减弱，部分抗原丢失。

在制作细胞蜡块过程中，采用12%中性甲醛固定离心后，细胞不易凝结在一起，不利于包埋，此时尽可能将试管中的液体取出，用吸管将细胞沉淀物吸出，置于玻片上，周围液体用滤纸吸干，向细胞沉淀物上滴上几滴95%乙醇，细胞沉淀凝固成块，易制作成细胞蜡块。95%乙醇与甲醇两者固定较迅速，细胞容易结成块，利于细胞蜡块制作。

综上所述，本文通过比较病理科常用的3种固定液在细胞块制作技术中的效果，得出12%中性甲醛效果最佳，不仅完好的保存了细胞形态，而且对抗原影响较小，得到了较满意的细胞蜡块HE和免疫组化染色结果，因此采用12%中性甲醛制作细胞蜡块的技术值得推广。