光动力疗法的抗肿瘤作用及其机制的研究进展

孙 旭，孟宪瑛，王瑶琪，杨 帅，逄仁柱，李 勇，石 亮

(吉林大学第一医院甲状腺外科，吉林 长春 130021)

肿瘤的治疗是目前医学领域最为棘手的难题之一。据统计，2016年美国约有1 685 210例新诊断出来的恶性肿瘤患者，其中约595 690例肿瘤患者死亡。对于早期诊断的实体肿瘤，手术的治疗效果较好，但对有转移的肿瘤，则需要手术联合放化疗。某些化疗药物对细胞分裂有影响，主要对毛囊、胃肠黏膜等方面有一定的不良反应。放射治疗是治疗肿瘤的重要手段，可以治疗全身转移的肿瘤，但是正常组织器官暴露在放射治疗中会产生严重的不良反应。因此，尽管手术、化疗和放疗是临床应对肿瘤的主要治疗手段，但是这些传统的治疗方法对于一些恶性肿瘤难以治愈，并且在治疗过程中给患者带来极大的痛苦。光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种联合利用光敏剂、光和氧分子，通过光动力学反应选择性地治疗恶性病变的非侵入性肿瘤治疗方法，能通过光敏剂结合在肿瘤部位，在特定波长的激光照射下产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，从而杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长[1]。血卟啉和替莫泊芬等光敏剂已经应用于临床肿瘤的治疗。PDT已成为一种有巨大应用潜力的治疗晚期肿瘤的新手段，其优势包括：①毒性小。给药后对局部病变区域的激光照射治疗才能产生ROS，诱导细胞凋亡,降低全身用药产生的不良反应;②无耐药性。PDT对局部有针对性;③保护其他器官。对有严重心脑等其他疾病不适宜手术治疗的患者，PDT是更好的治疗手段；④治疗更彻底。可避免遗漏手术过程中肉眼看不到的微小病灶，提高预后，以防复发[2]。

1 PDT的作用机制

1.1 ROS的产生PDT治疗中，光敏剂在近红外线的作用下可产生ROS，局部的ROS爆发具有促细胞凋亡作用[3]。ROS作为细胞新陈代谢的产物，起初被认为是有毒物质，引起许多人类疾病。ROS是细胞信号通路中重要信号分子，调控多种生理过程。ROS不仅可以产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化物质传递信号，而且是许多信号途径的第二信使，比如蛋白激酶B(AKT)途径、细胞周期蛋白调控的抑制细胞增殖途径、线粒体介导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)的细胞凋亡途径等。ROS对细胞的生长具有双重作用：一方面，低水平的ROS能促进细胞的有丝分裂来诱导细胞增殖，在一定范围内，ROS这种促细胞增殖的能力与其水平呈正相关关系；另一方面，过多的ROS会导致细胞通过凋亡或坏死途径死亡，ROS的水平越高，细胞通过坏死途径死亡的比例也越高。研究[4-5]表明:肿瘤细胞内的ROS水平相对于正常细胞较高，这可能是由于肿瘤的剌激、细胞内代谢的改变以及线粒体的紊乱，升高的ROS能刺激细胞增殖，导致突变的发生频率增加，诱导基因的不稳定性，改变细胞内抗肿瘤物质的敏感性。大量的ROS可激活线粒体通透性孔道，而开放的线粒体通透性孔道又可释放大量ROS，两者之间的正反馈使凋亡信号放大。线粒体外膜的可渗透性又与Ca2+含量有密切关联。氧化压力增高可以使细胞质内的Ca2+升高，从而导致线粒体内Ca2+的超载，进一步增加细胞内的ROS，继而又会使细胞内钙库中Ca2+释放增多，Ca2+因清除系统损害而积累增多，细胞内ROS增多，诱导细胞凋亡和坏死[6-7]。PDT治疗中，局部用激光照射，通过上述途径，产生过量的ROS，破坏细胞，从而达到治疗病灶的目的。

1.2 PDT对血管内皮生长因子(VEGF)的调节作用氧和营养物质通过血液循环运输到组织和肿瘤，当肿瘤直径小于0.1 cm时，血管主要用来运输氧气和营养物质，但是当肿瘤体积变大，肿瘤血管开始增生，肿瘤细胞向远处转移。PDT作用于血管，一方面，PDT可以通过减少肿瘤所需氧和营养物质来阻止肿瘤血管重建，使血管形态改变，因为光照在光敏剂上，能量会从氧转移到单线态氧，能进入组织内的氧气就会减少；另一方面，脉管系统中VEGF是血管重建的重要蛋白信号分子，是在细胞内和细胞外基质中被发现的一种分泌蛋白。VEGF是缺氧细胞的主要信号分子，PDT治疗后氧减少，刺激VEGF重建肿瘤血管[8-9]。2007年，Bhuvaneswari等[10]在鼻咽癌裸鼠模型血清和肿瘤组织中检测到VEGF，PDT治疗可下调VEGF表达，破坏肿瘤血管，并且是一个急性反应。

1.3 ROS对细胞凋亡的作用ROS可以通过不同的信号途径引起细胞凋亡。主要分为细胞内途径和细胞外途径。在细胞内，正常情况下线粒体膜、内质网膜以及核膜上的Bcl-2抗凋亡家族可抑制细胞色素C(cytochrome c)的释放，在PDT的作用下，ROS可以通过改变线粒体膜的通透性促进线粒体膜释放cytochrome C,与细胞内的凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1结合，从而导致ATP/dATP上的caspase 9释放，进而激活caspase 3和caspase 7，通过清除细胞内基质导致细胞凋亡[11-12]。随着cytochrome C的释放，其他的凋亡诱导因子，如AIF和HtrpA2等也大量释放，HtrpA2也是通过激活caspase系统导致细胞凋亡，AIF则主要是改变核染色质，产生大量DNA碎片导致细胞凋亡。在细胞外，ROS可以促进Ⅰ型跨膜糖蛋白受体(Fasl)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Trail)等死亡配体与细胞膜表面的受体结合，激活胞外的死亡受体，活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解前酶(procaspases) 8和10，激活procaspases 3和7，导致细胞凋亡[13]。

1.4 ROS对细胞坏死及自噬的作用坏死是核固缩、细胞质肿胀导致的细胞膜破裂，细胞内基质流出的过程。大量的ROS通过肿瘤坏死因子(TNF)直接引起细胞坏死，也可通过受体相互作用蛋白1(RIRP1)作用于Fas受体引起细胞坏死[14-15]。细胞自噬是引起细胞死亡的又一重要途径。Weyergang等[16]认为：在有凋亡能力的细胞中，ROS介导的细胞自噬是通过抑制Bcl-2和mTOR等细胞自噬负调节蛋白导致的。同时，Xue等[17]认为：细胞有无凋亡能力都存在细胞自噬现象，但其诱导细胞自噬的机制尚不明确，有待进一步研究。

2 光敏剂

2.1 传统光敏剂光敏剂在PDT中有重要的作用，受到广大研究者的关注。传统光敏剂主要分为第一代光敏剂和第二代光敏剂。伊红是第一个被使用的光敏剂，在印度、埃及等国家应用于皮肤癌的治疗。早在20世纪50年代，药品监管部门就意识到光卟啉在肿瘤组织中的扩散及治疗作用，并批准其用于临床治疗[18]。第一代光敏剂主要是光卟啉，可用于肺癌、膀胱癌、食管癌和早期宫颈癌的治疗，但其对肿瘤的特异性差，在血液内循环时间过长，吸收峰的波长较短，皮肤毒性大，并且其疏水不容易代谢，从而会不可避免地损伤其他组织，因此努力研究一种能够亲水，对不同肿瘤有特异性，且皮肤毒性小的光敏剂成为PDT发展的必然趋势。第二代光敏剂主要包括卟啉衍生物、叶绿素、染料及一些化合物，可以在正常组织和血浆中快速清除，并且相对富集于肿瘤组织内，提高治疗效果。5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid， ALA)是最早上市的第二代光敏剂，其激发光波长相对固定，毒性较小；有研究[19]证明：ALA能更多地进入肿瘤组织内。血卟啉和替莫泊芬等其他第二代光敏剂很多已经上市，主要应用于头颈部肿瘤和肺癌等的临床治疗，但其选择性仍然较弱，在肿瘤内的浓度并不理想，远不能满足临床需求。为此，近年来研究者们致力于修饰光敏剂来改进其治疗效果。

2.2 应用纳米颗粒修饰的光敏剂很多研究者提出了应用纳米载体递送光敏剂。大分子物质和脂质不易透过血管壁是由于正常组织中的微血管内皮间隙致密连续，而实体瘤组织中血管丰富、血管内皮间隙稀疏不完整，因此大分子物质和脂质可选择性通过滞留[20]，故光敏剂可以借助纳米载体进入肿瘤组织，提高浓度，增强治疗效果。Molina等[21]利用纳米沉淀法将人血清白蛋白制成了直径为(295±5) nm的纳米颗粒，用来包载光敏剂Ce6，人血浆白蛋白在血液中含量丰富，在新陈代谢和药物运输方面起到很大作用；其所研究的纳米颗粒可以减少在细胞外的滞留，同时细胞内环境的谷胱甘肽可以使纳米颗粒崩解，释放出光敏剂；研究者利用人的宫颈癌细胞系HeLa细胞、肺癌细胞系A549和正常的脐静脉上皮细胞HUVEC细胞在体外进行药物毒性实验，在黑暗环境下，分别转染光敏剂Ce6和经人血清白蛋白纳米颗粒包载的光敏剂Ce6，孵育24 h后，后者的细胞活力较高，说明经纳米颗粒包载的光敏剂未受到激光激发时，对正常组织细胞的毒性较小，产生的不良反应比较小。Wen等[22]将豌豆荚病毒和光敏剂联合起来，制成球状的纳米颗粒，由于豌豆荚病毒良好的安全性，较易进行改造，并且有较好的组织相容性，用黑色素瘤细胞系B16F10进行实验，用MTT法检测细胞活力，结果显示：豌豆荚病毒修饰光敏剂的纳米颗粒毒性较单独应用光敏剂大，对黑色素瘤细胞系B16F10治疗的效果也较好；流式细胞术和共聚焦显微镜的结果显示：应用豌豆荚病毒修饰光敏剂的纳米颗粒更容易被巨噬细胞吞噬，进入细胞内。应用纳米颗粒包载光敏剂，有减轻皮肤毒性，增加药物浓度，提高疗效等优势，成为近年来研究的热点。

3 PDT在肿瘤治疗中的应用

3.1 PDT在头颈部肿瘤治疗中的应用头颈部肿瘤的确诊一般较晚，预后差并且再发风险高，提高头颈部肿瘤患者的生存率至关重要。Muhanna等[23]提出PDT可有效诊断和治疗头颈部肿瘤：采用兔构建颊黏膜癌模型，用光敏剂卟啉类脂蛋白进行PDT，证实不论是原发的肿瘤还是远处转移的淋巴结都可以得到诊断，并且治疗效果明显，有较大的应用价值，但其并未进行临床试验。Lou等[24]进行二期临床试验，研究了45例晚期头颈部恶性肿瘤患者，该组患者对放、化疗均不敏感，经过PDT治疗后，其中9例(20%)患者完全治愈，4例(9%)患者无病生存期为13～60个月，8例(18%)患者存活时间超过1年，其中有2例患者存活时间甚至达到24～31个月，剩余24例(53%)患者临床症状缓解。可见PDT对于晚期肿瘤的治疗有较大应用价值。原发或者继发的脑部肿瘤发生率在逐年增高，其死亡率占所有恶性肿瘤的2%～3%，目前尚无有效的治疗方法，急需寻找一种新的治疗手段。Kaneko[25]对26个脑瘤患者共31个瘤灶进行PDT治疗结果显示：PDT治疗后4周采用MRI观察肿瘤大小，治疗的31个瘤灶均有不同程度的缩小，其中20个(64%)肿瘤的上部明显缩小，8个(26%)肿瘤的中间部分缩小，3个(10%)肿瘤的下部缩少，表明PDT对脑瘤治疗有效。由此可见，PDT在头颈部肿瘤中有很大的应用价值及前景。

3.2 PDT在其他肿瘤治疗中的应用PDT因其广泛的适用性在肿瘤治疗中备受关注。Fu等[26]采用PDT对有高度感染的人乳头瘤病毒(HPV)患者进行临床试验，结果显示：PDT可以安全有效地治疗高度感染HPV的患者，减少肿瘤的发生。He等[27]用光敏剂、脂质体和高分子化合物合成了一种壳-核结构的纳米颗粒，该颗粒不仅包载了光敏剂，还有化疗药奥沙利铂及程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)抗体，在动物实验中证实了PDT联合化疗及免疫疗法，三者间有协同效应，可有效治疗结肠癌，并且可以激活全身的免疫反应，治疗远处转移的癌灶，但其尚未进行临床试验。He等[28]报道了1例右足汗腺癌的患者，手术联合PDT治疗后，1年内未复发；采用单纯的手术治疗，汗腺癌极易复发，并向区域淋巴结转移，联合PDT治疗可降低其复发风险。Pereira等[29]在体外用人膀胱癌细胞系HT-1376细胞进行实验，MTT法检测PDT治疗后HT-1376细胞活性，结果表明：随着PDT中光敏剂浓度的增加，HT-1376细胞活性降低，即PDT的治疗效果与光敏剂浓度呈正相关关系，此外还提示重复激光激发光敏剂较单次激光激发的效果更好；同时，在体内给裸鼠皮下种植HT-1376细胞，进行PDT治疗，表明体外激光重复激发治疗效果明显好于单次激光激发治疗。Bown等[30]将PDT用于晚期膀胱癌的临床治疗，总结了16例患者的一期临床结果，结果表明：PDT能延长患者生存期，治疗效果较单纯化疗大大提高。另外，也有研究[31-33]证实： PDT可广泛应用于胰腺癌、基底细胞癌、骨肉瘤和黑色素瘤等的治疗。

PDT对于放化疗不敏感或病程晚期的恶性肿瘤均具有良好治疗效果，能提高患者的生活质量，随着光敏剂的改进，纳米颗粒递送系统的发展，PDT疗法的局限与不足逐步改善，并且还可以联合化疗药物及免疫疗法，容易操作，创伤小。但其应用于临床还有一定的限制，针对不同患者，如何制定个体化治疗方案，根据肿瘤的大小和深度确定治疗范围，以及光源的选择、功率的大小等均需进一步研究。PDT将是一种重要的治疗肿瘤的方法，在难治性肿瘤的治疗及清除残余病灶中有着巨大的应用潜力。

[1] Gong H,Chao Y,Xiang J,et al. Hyaluronidase to enhance nanoparticle-based photodynamic tumor therapy[J]. Nano Lett,2016,16(4):2512-2521.

[2] Wan MT,Lin JY.Current evidence and applications of photodynamic therapy in dermatology[J].Clin Cosmet Investigat Dermatol,2014,7(9):145-163.

[3] Yue C,Zhang C,Alfranca G,et al.Near-infrared light triggered ROS-activated theranostic platform based on Ce6-CPT-UCNPs for simultaneous fluorescence imaging and chemo-photodynamic combined therapy [J].Theranostics,2016,6(4):456-469.

[4] Gibellini L,Pinti M,Nasi M,et al.Interfering with ROS metabolism in cancer cells:the potential role of quercetin[J].Cancers,2010,2(2):1288-1311.

[5] Sosa V,Moliné T,Somoza R.et al.Oxidative stress and cancer:an overview[J].Ageing Res Rev,2013,12(1):376-390.

[6] Sena LA,Chandel NS.Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species[J].Mol Cell,2012,48(2):158-167.

[7] Prinz C,Vasyutina E,Lohmann G,et al.Organometallic nucleosides induce non-classical leukemic cell death that is mitochondrial-ROS dependent and facilitated by TCL1-oncogene burden[J].Mol Cancer,2015,14(1):114.

[8] Bucher F,Bi Y,Gehlsen U,et al.Regression of mature lymphatic vessels in the cornea by photodynamic therapy[J].Br J Ophthalmol,2014,98(3):391-395.

[9] Bhuvaneswari R,Gan YY,Soo KC,et al.The effect of photodynamic therapy on tumor angiogenesis[J].Cell Mol Life Sci,2009,66(14):2275-2283.

[10]Bhuvaneswari R,Gan YY,Yee KK,et al.Effect of hypericin-mediated photodynamic therapy on the expression of vascular endothelial growth factor in human nasopharyngeal carcinoma[J].Int J Mol Med,2007,20(20):421-428.

[11]Coupienne I,Fettweis G,Rubio N,et al.5-ALA-PDT induces RIP3-dependent necrosis in glioblastoma[J].Photochem Photobiol Sci,2011,10(12):1868-1878.

[12]Sülogu AK,Karacaoglu E,Selmanoglu G,et al.Evaluation of apoptotic cell death mechanisms induced by hypericin-mediated photodynamic therapy in colon cancer cells[J].Turkish J Biol,2016,40(3):539-546.

[13]Awad MM,Tovmasyan A,Craik JD,et al.Important cellular targets for antimicrobial photodynamic therapy[J].Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(17):7679-7688.

[14]Vanden Berghe T,Grootjans S,Goossens V,et al.Determination of apoptotic and necrotic cell deathinvitroandinvivo[J].Methods，2013,61(2):117-129.

[15]Vandenabeele P,Galluzzi L,Vanden Berghe T,et al.Molecular mechanisms of necroptosis:an ordered cellular explosion[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(10):700-714.

[16]Weyergang A,Berg K,Kaalhus O,et al.Photodynamic therapy targets the mTOR signaling networkinvitroandinvivo[J].Mol Pharm,2009,6(1):255-264.

[17]Xue LY,Chiu SM,Azizuddin K,et al.Protection by Bcl-2 against apoptotic but not autophagic cell death after photodynamic therapy[J].Autophagy,2008,4(1):125-127.

[18]Seshadri M,Bellnier DA,Vaughan LA,et al.Light delivery over extended time periods enhances the effectiveness of photodynamic therapy[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2796-2805.

[19]Silva P,Fonseca SM,Arranja CT,et al.A new nonconjugated naphthalene derivative of meso-tetra-(3-hydroxy)-phenyl-porphyrin as a potential sensitizer for photodynamic therapy[J].Photochem Photobiol,2010,86(5):1147-1153.

[20]Maeda H.Toward a full understanding of the EPR effect in primary and metastatic tumors as well as issues related to its heterogeneity[J].Adv Drug Deliv Rev,2015,9(1):3-6.

[21]Molina AM,Morales-Cruz M,Benítez M,et al.Redox-sensitive cROSs-linking enhances albumin nanoparticle function as delivery system for photodynamic cancer therapy[J].J Nanomed Nanotechnol,2016,6(3):294-302.

[22]Wen AM,Lee KL,Cao P,et al.Utilizing viral nanoparticle/dendron hybrid conjugates in photodynamic therapy for dual delivery to macrophages and cancer cells[J].Bioconjug Chem,2016,27(5):1227-1235.

[23]Muhanna N,Cui L,Chan H,et al.Multimodal image-guided surgical and photodynamic interventions in head and neck cancer:from primary tumor to metastatic drainage[J].Clin Cancer Res,2016,22(4):961-970.

[24]Lou PJ,Jäger HR,Jones L,et al.Interstitial photodynamic therapy as salvage treatment for recurrent head and neck cancer[J].Br J Cancer,2004,91(3):441-446.

[25]Kaneko S.Recent advances in PDD and PDT for malignant brain tumors[J].Rev Laser Engineer,2008,36(36):1351-1354.

[26]Fu Y,Bao Y,Hui Y,et al.Topical photodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid for cervical high-risk HPV infection[J].Photodiagnosis Photodyn Ther,2016,13:29-33.

[27]He C,Duan X,Guo N,et al.Core-shell nanoscale coordination polymers combine chemotherapy and photodynamic therapy to potentiate checkpoint blockade cancer immunotherapy[J].Nat Commun,2016,7:12499.

[28]He X,Yang Y,Yang Y,et al.Treatment of sweat gland carcinoma with topical aminolevulinic acid photodynamic therapy:An effective treatment method to improve surgical outcomes[J].Photodiagnosis Photodyn Ther,2017,17:233-235.

[29]Pereira PM,Silva S,Bispo M,et al.Preclinical study on mitochondria-targeted photodynamic therapy using a galactodendritic chlorin for bladder cancer[J].Bioconjug Chem,2016,27(11):2762-2769.

[30]Bown SG,Rogowska AZ,Whitelaw DE,et al.Photodynamic therapy for cancer of the pancréas[J].Acta Endoscopica,2003,33 (4):531-538.

[31]Lu K,He C,Lin W.A Chlorin-Based Nanoscale Metal-Organic Framework for Photodynamic Therapy of Colon Cancers[J].J Am Chem Soc,2015,137(24):7600-7603.

[32]Wan MT,Lin JY.Current evidence and applications of photodynamic therapy in dermatology[J].Clin Cosmet Investig Dermatol,2014,7:145-163.

[33]Yokoyama Y,Shigeto T,Miura R,et al.Differences in the sensitivity of ovarian cancer to photodynamic therapy and the mechanisms for those differences[J].Oncol Lett,2017,13(6):4933-4938.