咖啡因联合电离辐射对沉默Chk-1肝癌干细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

于 雷，王志成，王铁君

(1.吉林大学第二医院放疗科，吉林 长春 130041；2.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021)

肝癌是全球5大常见肿瘤之一，放射治疗已经成为原发性肝癌的治疗手段，并在我国的原发性肝癌诊治指南得到推荐[1]。但是，由于肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的存在，导致肿瘤的复发和转移，而且是肿瘤放疗抵抗的重要原因之一[2]，因此如何提高肝癌放疗效果成为目前研究的热点之一。肿瘤细胞受到辐射后，DNA的损伤如未修复则发生细胞凋亡[3]，检查点激酶1(checkpoint kinase 1，Chk-1)是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可有效调节细胞周期进程，具有重要的生理功能，当Chk-1被抑制后，则调控周期阻滞的功能消失，使其成为肿瘤治疗的重要靶点。另外，咖啡因(caffeine)是一种茶叶、可可豆和咖啡果中的提取物，近期研究显示其具有抗肿瘤作用，并且取得了较好的效果[4-6]。本研究探讨咖啡因增强辐射对沉默了Chk-1的CD133+肝癌HepG2细胞增殖、周期和凋亡的作用，为改善肝癌细胞放疗抵抗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂人肝癌HepG2细胞和人肾上皮293T细胞由吉林大学公共卫生学院王志成博士惠赠。培养血清及高糖DMEM培养基(江苏恩莫阿塞生物技术有限公司)，DMEM/F12培养基、靶向沉默Chk-1的慢病毒载体pGIPZ-Chk-1 shRNA(第6外显子)、非靶对照载体pGIPZ-control shRNA、质粒pMD2G和pSPAX2由吉林大学卫生部放射生物学重点实验室保存；转染试剂Lipofectamine 2000和B27(美国Invitrogen公司)，puromycin、MTT试剂、咖啡因和碘化丙啶(PI)(美国 Sigma公司)，重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和重组人表皮生长因子(EGF)(美国Peprtech公司)，牛血清白蛋白(BSA)(美国Gbico公司)，AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，CD133一抗(美国Abcam公司)，GAPDH、Chk-1兔多克隆抗体和ECL发光试剂盒(美国Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(北京中山金桥公司)，其他试剂为国产分析纯。

1.2 沉默Chk-1的HepG2细胞模型的建立293T细胞接种6孔板，待80%～90%融合时，利用Lipofectamine 2000转染试剂将pGIPZ-Chk-1 shRNA、pMD2G和pSPAX2质粒共转染到293T细胞中，48和72 h收取上清液并利用0.45 μm滤膜过滤后加到培养于6孔板80%～90%融合的HepG2细胞中，共感染2次。通过观察绿色荧光的状态判定感染的效率，并加入50 g·L-1的puromycin 10 μL进行阳性筛选，将获得的细胞命名为HepG2-Chk-1，以pGIPZ-control作为非靶对照，命名为HepG2-control，冻存备用。

1.3 Western blotting法检测Chk-1蛋白的表达收集HepG2、HepG2-Chk-1和HepG2-control组细胞，利用RIPA裂解细胞，总蛋白提取后进行定量，按照25 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转到硝酸纤维膜后，利用TBST配置的5%脱脂奶粉封闭1 h，4℃过夜GAPDH和Chk-1一抗孵育。含有0.05%Tween 20的TBST洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃下孵育1 h，TBST洗3次，利用化学发光试剂ECL进行显像，并进行拍照分析。

1.4 沉默Chk-1的肝癌干细胞的获得参照文献[7-8]进行肝癌干细胞的悬浮培养，DMEM/F12培养基中加入20 μg·L-1EGF、10 μg·L-1bFGF、2% B27、0.4% BSA、100 U· mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素，于37℃、5% CO2条件下培养，约6 d可形成悬浮球，采用Western blotting法检测CD133蛋白表达确定是否为肝癌干细胞，命名为S-HepG2-Chk-1细胞(沉默Chk-1的肝癌干细胞)和S-HepG2-control细胞(肝癌干细胞)。

1.5 细胞分组和照射S-HepG2-Chk-1和S-HepG2-control细胞分别分为对照组、咖啡因(0.2 mmol·L-1)组、4 Gy组和4 Gy+咖啡因组。 X射线照射采用X-RAD320生物辐照仪(美国PXI公司)，照射条件：电压 180 kV，电流12.0 mA，靶皮距70 cm，剂量率 1.0 Gy·min-1，总剂量为4 Gy。

1.6 MTT法检测细胞增殖活性收集各组肝癌干细胞悬浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照1× 104个/孔接种96孔板，参照1.4中的方法继续培养，12 h后加入终浓度为0.2 mmol·L-1的咖啡因，24 h后进行X射线照射，计为0 h，分别于4、12、24和48 h加入MTT试剂，再培养4 h后吸去上清，加DMSO到孔底结晶处，于酶标仪上490 nm处测定吸光度[A(490)]值，代表其增殖活性。

1.7 流式细胞术检测细胞周期收集肝癌干细胞悬浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照4 × 105个/孔接种24孔板，参照1.4中的方法继续培养12 h后加入终浓度为0.2 mmol·L-1的咖啡因，24 h后进行X射线照射，24 h后收集细胞，1 mol·L-1PBS洗2次，每个管中加入200 μL PI和100 μL RNaseA，轻微震荡混匀，室温条件避光20 min，上机收细胞，CellQuest软件收集，ModFit软件分析数据，结果以各期细胞百分率表示。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组肝癌干细胞悬浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照4 × 105个/孔接种24孔板，参照1.4中的方法继续培养，12 h后加入终浓度为0.2 mmol·L-1的咖啡因[9]，24 h后进行X射线照射，24 h后收细胞，1 mol·L-1的PBS洗2次，每个管中加入5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC试剂，混匀后避光10 min，上机收细胞，CellQuest软件收集数据，ModFit软件分析，细胞凋亡率以百分率表示。

2 结 果

2.1 沉默Chk-1的HepG2细胞模型的鉴定利用转染293T细胞获得的慢病毒感染HepG2细胞后获得稳定沉默Chk-1的细胞模型，通过Western blotting法检测Chk-1蛋白的表达。HepG2和非靶对照shRNA的HepG2细胞中均可见Chk-1蛋白的表达，而靶向沉默Chk-1的HepG2细胞中Chk-1蛋白低表达，表明本研究获得的沉默Chk-1的HepG2细胞模型成功。见图1。

Lane 1：HepG2 cells；Lane 2：HepG2-control shRNA cells；Lane 3：HepG2-Chk-1 shRNA cells.

2.2 肝癌干洗胞悬浮球中CD133蛋白的表达根据Yoshikawa等[10]报道，肝癌干细胞表面标志为CD133。在悬浮培养6 d后，收集细胞采用Western blotting法检测，HepG2-control和HepG2-Chk-1细胞中可见CD133蛋白表达，而将2种细胞悬浮培养后，CD133蛋白均高表达，提示细胞中高比例的CD133+细胞为肝癌干细胞。见图2。

Lane 1：HepG2-control cells；Lane 2：HepG2-Chk-1 cells；Lane 3：S-HepG2-control cells；Lane 4：S-HepG2-Chk-1 cells.

2.3 各组细胞增殖活性采用MTT比色法检测细胞增殖活性。在相同时间点，与对照组比较，同一种细胞的增殖活性均明显降低(除了4 h时S-HepG2-control细胞)(P<0.05或P<0.01)，且以咖啡因 + 4 Gy组的细胞活性最低；与S-HepG2-control细胞比较，48 h时对照组，4、12、24和48 h时咖啡因组，12、24和48 h时4 Gy组，以及4、12、24和48 h时咖啡因 +4 Gy组 S-HepG2-Chk-1细胞活性均明显降低(P<0.01)。见表1。

2.4 各组细胞不同细胞周期百分率与对照组比较，咖啡因组S期和G2/M期细胞百分率明显增加(P<0.05或P<0.01)，4 Gy组G0/G1期和G2/M期细胞百分率明显增加(P<0.01)；咖啡因 + 4 Gy组S期细胞百分率明显降低，而G2/M期细胞百分率明显增加(P<0.05或P<0.01)。与S-HepG2-control 细胞比较，S-HepG2-Chk-1细胞G2/M期细胞百分率均明显降低(P< 0.05或P< 0.01)。见表2。

表1 各组沉默Chk-1的肝癌干细胞的增殖活性

Tab.1 Proliferation activities of hepatocellular carcinoma stem cells silenced by Chk-1 in various groups

表1 各组沉默Chk-1的肝癌干细胞的增殖活性

GroupCellsA(490)value(t/h) 4122448ControlS⁃HepG2⁃control0．62±0．020．68±0．010．74±0．020．85±0．01S⁃HepG2⁃Chk⁃10．62±0．010．67±0．020．71±0．010．80±0．01△△CaffeineS⁃HepG2⁃control0．60±0．010．64±0．01∗0．68±0．01∗0．69±0．02∗∗S⁃HepG2⁃Chk⁃10．56±0．02∗△0．61±0．01∗△0．63±0．02∗∗△0．55±0．02∗∗△△4GyS⁃HepG2⁃control0．54±0．02∗∗0．58±0．01∗∗0．63±0．01∗∗0．70±0．01∗∗S⁃HepG2⁃Chk⁃10．50±0．01∗∗0．53±0．01∗∗△0．57±0．01∗∗△0．59±0．01∗∗△△Caffeine+4GyS⁃HepG2⁃control0．41±0．02∗∗0．42±0．01∗∗0．54±0．01∗∗0．56±0．01∗∗S⁃HepG2⁃Chk⁃10．11±0．01∗∗△△0．12±0．01∗∗△△0．21±0．02∗∗△△0．31±0．01∗∗△△

*P< 0.05,**P< 0.01vscontrol group;△P< 0.05,△△P< 0.01vsS-HepG2-control cells.

表2 各组沉默Chk-1的肝癌干细胞不同周期细胞百分率

Tab.2 Percentages of hepatocellular carcinoma stem cells silenced by Chk-1 at different phages in various groups

表2 各组沉默Chk-1的肝癌干细胞不同周期细胞百分率

GroupCellsPercentageofcellsG0/G1SG2/MControlS⁃HepG2⁃control47．07±0．9349．57±0．923．36±0．21S⁃HepG2⁃Chk⁃153．95±0．35△45．00±0．34△1．05±0．06？CaffeineS⁃HepG2⁃control32．80±1．49∗∗60．43±1．62∗6．77±0．31∗∗S⁃HepG2⁃Chk⁃145．31±0．63∗∗△49．24±0．71∗△5．45±0．40∗△4GyS⁃HepG2⁃control50．20±0．66∗31．84±1．33∗∗17．96±0．69∗∗S⁃HepG2⁃Chk⁃157．03±0．28∗∗△33．00±0．47∗∗9．97±0．71∗∗△△Caffeine+4GyS⁃HepG2⁃control34．67±0．92∗∗39．03±0．55∗∗26．30±1．11∗∗S⁃HepG2⁃Chk⁃150．14±0．87∗△△30．85±0．49∗∗△△19．01±0．47∗∗△

*P< 0.05,**P< 0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P< 0.01vsS-HepG2-control cells.

2.5 各组细胞凋亡率与对照组比较，咖啡因组、4 Gy组和咖啡因 + 4 Gy组细胞凋亡率均明显增加(P< 0.05或P< 0.01)，且咖啡因 + 4 Gy组增加最明显；与S-HepG2-control细胞比较，各组S-HepG2-Chk-1细胞凋亡率均明显增加(P< 0.05或P< 0.01)。见表3和图3。

3 讨 论

CSC为肿瘤组织中存在的非常小比例的细胞，具有无限自我更新和增殖能力，维持细胞群的生命力。CSC长时间处于休眠状态，对肿瘤的存活、增殖、转移和复发具有重要作用，同时也是肿瘤放疗抵抗和化疗多药耐药的影响因素之一，以CSC为靶点的肿瘤治疗策略越来越引起重视[11-12]。原发性肝癌包括肝细胞癌和肝内胆管癌，有学者认为可能部分起源于肝癌干细胞。目前，识别CSC的表面标志物被认为是鉴定CSC的重要途径。肝癌干细胞具有多个表面标志物，如CD133、CD90、CD44、OV6和EpCAM等[13]。在本研究中悬浮培养6 d后，检测肝癌干细胞表面标志物CD133蛋白表达结果显示：与未悬浮的相同细胞比较，CD133蛋白呈高表达，提示有高比例的肝癌干细胞存在，为后续实验提供了保障。

表3 各组沉默Chk-1的肝癌干细胞的凋亡率

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsS-HepG2-control cells.

A-D:S-HepG2-control cells;E-H:S-HepG2-Chk-1 cells;A,E:Control group;B,F:Caffeine group;C,G:4 Gy group;D,H:Caffeine+4 Gy group.

肿瘤放疗时损伤细胞的一个重要的机制就是诱导DNA损伤，继而导致细胞最终走向死亡。DNA损伤时细胞周期Chk-1/2在限制细胞周期进展的DNA损伤反应通路中发挥重要作用[14]。肿瘤临床放疗时，往往因肿瘤细胞逃避了凋亡，使得以诱导细胞凋亡为目的的治疗方案效果降低，这与细胞周期检查点的活化关系密切。当细胞遭受DNA损伤剂作用时，Chk1被激活，致使细胞停留在S和G2/M期检查点，保证DNA有充足的时间完成修复，从而维持基因组的稳定性[15]。本研究中靶向Chk-1第6外显子的靶向RNAi慢病毒pGIPZ-Chk-1感染肝癌细胞HepG2后，Western blotting法检测结果显示：Chk-1蛋白表达大大降低，具有较好的沉默效果，而对照序列的慢病毒则不影响Chk-1蛋白的表达。另外，流式细胞术检测Chk-1被沉默的HepG2细胞和对照序列的HepG2细胞周期结果显示：G2/M期细胞百分率明显降低，表明经过悬浮培养后沉默Chk-1的细胞更少的处于G2/M期。

2013年，美国国家综合癌症网络(NCCN)肝癌诊治指南推荐：原发性肝癌患者无论肿瘤位于何处，都适合外照射放疗。我国也在肝癌诊治指南中推荐肝癌放疗，而肿瘤放疗与其他疗法的联合应用则具有更高的治疗效果。咖啡因广泛存在于茶叶、咖啡和其他饮料中，有研究[16]表明：咖啡因能够通过诱发细胞凋亡和抑制增殖实现抗肿瘤效应。放疗也可以诱导肿瘤细胞凋亡，因此本研究将二者结合以增加彼此的诱导凋亡作用，并且以沉默了Chk-1的肝癌干细胞为靶细胞。沉默了Chk-1后G2/M期细胞比例减少，而该细胞周期是对X射线最敏感的期，这将对放射效果产生影响，但从本研究结果来看，二者协同作用于沉默Chk-1的肝癌干细胞能明显提高其增殖抑制和凋亡促进效果。另外，咖啡因对于细胞周期的影响主要集中在S相延迟和G2/M期阻滞，而4 Gy照射则诱导G0/G1和G2/M期阻滞，对于逆转因缺少Chk-1调控周期检查点监控失调具有一定的作用。

综上所述，由沉默了Chk-1的HepG2细胞悬浮培养获得的肝癌干细胞G2/M期比例降低，本身不利于细胞维持正常化，但对于肿瘤来说，则有利于以此为突破口进行靶向治疗。咖啡因和电离辐射均可诱导细胞凋亡，二者联合应用大大增强了单一治疗的效果。本研究结果为肝癌的放射治疗提供了新的实验数据和思路。

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