钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在窦房结中的生物学作用

聂大安 综述 李景东 审校

(华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北 武汉 430022)

窦房结(SAN)是哺乳动物心脏的正常起搏点，膜钟学说和钙钟学说是目前SAN起搏的主流理论[1-2]。Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在SAN起搏过程中具有重要的调控作用[3]。本文将讨论CaMKⅡ在SAN中的作用及其机制，并阐述CaMKⅡ在SAN功能障碍中的致病机制。

1 CaMKⅡ的生物学特性

CaMKⅡ是一种广泛分布于人体内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族蛋白，包括α、β、γ、δ四种亚型；其中δ型是CaMKⅡ在心脏中表达的主要亚型，可分为CaMKⅡδB、CaMKⅡδC两种剪接体。CaMKⅡδ由12个亚基组成，每个亚组又由三个结构域构成，即氨基端的催化结构域、羧基端的结合结构域及中间的调节结构域。其中，催化结构域为底物和ATP结合部位，具有催化功能；调节结构域分为钙调蛋白结合区和假底物区(或自身抑制区)，能够调节CaMKⅡ活性；结合结构域能够参与全酶的各亚基组装过程及其亚细胞定位。在基础状态时，调节域会抑制催化区的功能，使CaMKⅡ处于失活状态；当细胞内Ca2+浓度升高后，Ca2+与钙调素结合，形成钙/钙调复合物；继而复合物与CaMKⅡ结合，将消除调节域的抑制性作用，使催化结构域暴露，以催化下游靶蛋白磷酸化[4]，而调节细胞生理功能。

2 CaMKⅡ调节SAN起搏功能的机制

膜钟学说和钙钟学说[2]涉及SAN细胞内的诸多离子通道和信号调节蛋白。钙钟学说认为，肌质网(SR)的周期性局部钙释放可激活细胞膜上的钠钙交换器，后者在排出一个Ca2+的同时泵入三个Na+，形成内向钠钙交换电流INCX，从而使细胞内负性膜电位绝对值降低，并逐渐达到L型钙通道的阈电位水平，诱发产生ICa-L，使细胞膜周期性舒张期自动除极[5]；膜钟学说主张，SAN动作电位与超极化激活的内向电流If有关，当If激活后，以1∶3 到1∶5 的比率将细胞内钾离子排出细胞外和将细胞外钠离子泵入细胞内，其净效应为内向电流，使细胞内膜电位绝对值减少，在达到阈电位水平后同样激活L型钙通道，进而推动SAN细胞在舒张期自动除极[6]。膜钟和钙钟相互影响，并受到诸多因素调控[1,7]。CaMKⅡ是调节SAN细胞起搏活动的重要信号分子。CaMKⅡ过影响下列离子通道和相关蛋白分子而调节SAN起搏功能。

2.1 CaMKⅡ调控Ca2+活动

CaMKⅡ能够作用于多个细胞内钙稳态调控靶点，包括细胞膜Ca2+通道和SR钙稳态相关蛋白。Terrar等[8]的研究发现，CaMKⅡ在心房肌和SAN中的效应部位主要位于SR，CaMKⅡ通过增强SR钙释放而激活腺苷酸环化酶间接影响心房Ca2+通道。受磷蛋白(PLB)和兰尼碱受体2(RyR2)未受到CaMKⅡ磷酸化时能够负性调节SR的Ca2+-ATP酶2a，经CaMKⅡ催化磷酸化后其负性调节作用消除[3]。PLB磷酸化后，SR经SR的Ca2+-ATP酶2a从胞浆中摄取的Ca2+增加；RyR2上包括丝氨酸2814在内的几个磷酸化位点磷酸化后，SR经RyR2释放的Ca2+增加[3]。因此，CaMKⅡ能够促进Ca2+从胞浆中进入SR，再经RyR2释放Ca2+促进局部钙释放，最后加快钠钙交换体的钠钙交换速度，最终使SAN动作电位频率增加，应激时小鼠的心率反应速度加快[3]。

CaMKⅡ能够调控钙火花，该过程独立于蛋白激酶A(PKA)对PLB的磷酸化调节作用，但前提是异丙肾上腺素(ISO)浓度要达到一定阀值，否则SAN的心率加快仍然主要受PKA影响[9]，即交感神经活性必须足够强并达到一定阈值，并受细胞内Ca2+浓度及其生物学活动过程影响，当交感神经活动不显著时，CaMKⅡ调控SAN起搏功能的重要性不大。

2.2 CaMKⅡ调控If

2.3 CaMKⅡ调控钾电流

在AC3-I小鼠心室肌细胞中，抑制CaMKⅡ能够通过PLB上调心室肌细胞中的Ito和Ik1，缩短动作电位时程，同时伴有PKA上调导致的ICa上调，但急性阻断CaMKⅡ时却无该作用。这些现象表明，小鼠心室肌细胞动作电位时程缩短是CaMKⅡ长期受到抑制的一种适应性表型转变[14]，尚未有研究报道CaMKⅡ是否能够调节SAN的Ito和Ik1。

2.4 CaMKⅡ调控应激反应时的心率

Wu等[9]发现ISO刺激或者应激反应时，约50%的心率加快反应需要CaMKⅡ参与。CaMKⅡ抑制剂KN-93能以剂量依赖方式抑制SAN自发性动作电位的频率和幅度，局部的钙瞬变能通过调节CaMKⅡ活性影响ICa-L的失活和复活，CaMKⅡ活性对基础状态时的SAN动作电位形成意义重大[18]。当用大剂量ISO刺激含CaMKⅡ抑制性肽段的AC3-I小鼠的SAN细胞时，该SAN细胞的最大舒张电位维持不变，细胞中SR的钙火花时程和程度、钙瞬变增加最大速率未见明显改变，但SAN细胞SR自发性舒张期钙释放频率和钙摄取减慢，SR钙含量降低，舒张期去极化速率和动作电位频率也继而降低，产生心率降低效应[9]。另一CaMKⅡδ基因敲除小鼠的研究也证实了SR的钙含量降低、钙火花减少现象[19]，此过程受到胞内钙浓度和钙瞬变的精密调控，AC3-I小鼠SAN细胞SR中的钙存储、钙释放和钙摄取都受到了抑制，从而减慢心率反应。

总之，SAN在调控其应激反应过程中需要CaMKⅡ的存在，CaMKⅡ主要通过钙稳态调节影响应激状态时的心率。

3 CaMKⅡ调节SAN的能量代谢的机制

CaMKⅡ不仅能够调节SAN的自律性，还能影响SAN的能量代谢过程。当CAMKⅡ受到特异性药物抑制时，SAN细胞内的Ca2+循环周期动力学减慢，自发性动作电位发生速率降低，且cAMP、氧耗和黄素蛋白均减少[20]，这些都会影响SAN细胞的能量代谢。Lakatta发现了SAN细胞在高ATP需求下动作电位发生时的ATP供给机制：当线粒体内钙浓度升高时，Ca2+激活的cAMP-PKA-CaMKⅡ信号途径将参与调节动作电位，此时ATP需求增加。若细胞内ATP低于基线水平，cAMP-PKA-CaMKⅡ-线粒体信号途径将提高ATP产量以增加能量供应。在此过程中，Ca2+和cAMP浓度增加，并伴有氧耗增加，但ATP黄素蛋白仍保持不变[21]。因此，CaMKⅡ能通过调节SAN细胞的离子电流影响起搏活动时同步调节SAN细胞的能量代谢过程，以保证和匹配其完成SAN自律性活动的调节功能。

然而，SAN高自律性所伴随的高能量耗费方式若长期存在，则有可能对SAN有潜在的损害作用。譬如，在高代谢状态下，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)激活的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶[22]或糖尿病小鼠血液中的高血糖诱导线粒体生成过多的活性氧(ROS)[23]均能将CaMKⅡ氧化为ox-CaMKⅡ，诱导SAN细胞凋亡，导致SAN功能障碍。

4 ROS通过CaMKⅡ诱导SAN功能障碍

CaMKⅡ可被ROS激活[24]，CaMKⅡ活性过强会引起钙超载，诱导ROS生成增加，并最终导致SAN细胞损伤或者死亡[22-23]。SAN功能障碍患者和犬心房中的ox-CaMKⅡ水平均上升。给予野生型小鼠输注AngⅡ 3周后，小鼠SAN中ox-CaMKⅡ水平增加，并促进SAN细胞凋亡、SAN和心房组织纤维化、心房冲动传导速率减慢，并最终导致SAN功能障碍，这一过程可被敲除NADPH氧化激酶或抑制CaMKⅡ功能而阻断[22-23]。AngⅡ触发的SAN功能障碍过程能被CaMKⅡ抑制性肽段AC3I阻断[25]。CaMKⅡ抑制性肽段CaMKⅡN只存在于神经元而不表达于心脏[26]，心脏异位性转基因表达CaMKⅡN也能抑制SAN功能障碍[27]。此外，AngⅡ诱导SAN的ox-CaMKⅡ表达需要率先激活NADPH氧化酶，缺乏该酶的p47-/-小鼠则未表现出显著的SAN功能障碍[28]。

人SAN中的ox-CaMKⅡ表达在心房颤动心房中高于非心房颤动心房，而给小鼠进行AngⅡ灌注会诱导增加心房颤动[29]，从侧面解释了心房颤动易致SAN功能障碍的生物学机制。转基因表达AC3-I或基因敲入CaMKⅡδ突变片段MM-VV会阻断氧化激活过程，转基因过表达甲硫氨酸亚砜还原酶A(能够逆转甲硫氨酸第一步氧化状态)的小鼠对AngⅡ诱导的心房颤动也表现出耐受现象[3]。这些研究表明ox-CaMKⅡ可以作为SAN功能障碍和心房颤动同时存在的信号。

因此，ox-CaMKⅡ或可视为SAN功能障碍的生物标志物，CaMKⅡ抑制剂可能为SAN功能障碍高危患者的潜在治疗药物。

5 高血糖通过CaMKⅡ诱导SAN功能障碍

1992年有人报道，糖尿病是SAN疾病的危险因素[30]。后来的研究证实糖尿病患者心肌梗死后的右心房中含有比正常人更高的ox-CaMKⅡ[23]，提示CaMKⅡ在高血糖致SAN疾病中起着重要作用。在高血糖状态下，糖尿病小鼠的线粒体会生成过多的ROS，后者可将CaMKⅡ氧化为ox-CaMKⅡ，从而诱导SAN细胞凋亡，使SAN纤维化，并降低SAN功能及减慢其与心房肌间的传导，导致心率减慢、心排血量减少，最终促成心肌梗死后患糖尿病小鼠的高死亡率，阻断CaMKⅡ可降低这些小鼠的死亡率[23]；AC3-I对死亡率升高的糖尿病心肌梗死小鼠的SAN具有保护作用，意味着链脲佐菌素处理后的糖尿病小鼠的过多ox-CaMKⅡ是过高死亡率的必要条件[25]。链脲佐菌素处理小鼠在心肌梗死后死亡缘于严重的心动过缓，这与另一糖尿病动物模型研究观察到心脏起搏功能缺陷的现象相一致[31]。

因此，CaMKⅡ及其氧化产物能够诱导SAN功能障碍，导致心律失常。由此可见，高血糖激活的线粒体ox-CaMKⅡ信号途径将使合并有糖尿病的心肌梗死患者早死率增加，抑制CaMKⅡ功能及其ox-CaMKⅡ水平能够有效遏制心肌梗死后SAN功能障碍和死亡等不良结局。

6 研究展望

综上所述，CaMKⅡ可以通过调节SAN细胞的动作电位，以Ca2+依赖方式增强SAN细胞的IKs，调节SAN细胞的生物能量动力学过程，参与SAN的起搏功能活动；鉴于SAN起搏过程中有诸多离子通道和生物大分子参与，膜钟和钙钟相互影响，机制复杂，CaMKⅡ是否能够通过其他机制，如调节Ik1、Ito和If调控SAN起搏，仍需进一步的深入研究。糖尿病或AngⅡ激活并氧化为ox-CaMKⅡ，对促进SAN功能障碍具有危害性作用。因此，进一步阐明CaMKⅡ在SAN功能中的作用及机制，可以为CaMKⅡ作为潜在治疗心律失常的药物靶点奠定基础；如在高血糖或者高应激状态时，CaMKⅡ抑制剂对SAN功能障碍具有潜在的治疗作用。

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