新型分子诊断技术在动物疫病检测中的应用与发展

庄向婷，白 军，张振仓

（杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100）

随着生命医学和科学技术的快速发展，基于分子生物学技术对病原体进行测定的分子诊断技术，大大提高了动物病原体的检测水平，从分子水平探讨疾病发生和发展的机制，为动物疫病的预防、诊断和治疗提供信息和决策的依据。分子诊断技术发展至今，主要分为传统分子诊断技术（核酸杂交技术、聚合酶链反应技术和限制性酶切技术等）和新型分子诊断技术（实时荧光PCR技术、基因芯片技术和核酸扩增技术等）。近些年来，一些新型分子诊断技术逐步实现了分子检测的自动化和高通量，并应用于动物疫病诊断，有效提高了疫病确诊速度与准确性，为及时控制疫情提供了决策依据。该文就目前所应用的几类新型分子诊断技术在动物疫病检测中的原理及实践应用进行简单介绍和评论，并对其发展趋势与前景作出展望。

1 新型分子诊断技术在病原检测中的分类及应用

病原体的检测是动物疫病确诊的基石，对采取防控措施、提高疗效、改善预后、降低费用有着极其重要的作用。但是某些病原体造成的传染病感染部位深、数量少、采样困难，在临床实验室病原微生物培养条件下，增长缓慢或难以培养，导致检出率不高。传统分子诊断技术又存在操作步骤繁琐、工作量大、周期长等不足，无法满足临床早期、快速诊断以及治疗、防控疾病的需要。随着分子检测技术的逐步发展，许多新型的分子诊断技术具有效率高、特异性强、敏感性高等优势，在传染性疫病检测领域的应用逐渐成熟。

1.1 实时荧光PCR技术

Higuchi于1992年提出实时观测PCR反应整个过程的构想。基于普通的PCR反应，在进行核酸扩增的过程中，掺入到双链核酸中的荧光基团或者荧光染料随着每一次的扩增循环嵌入释放荧光，通过对所释放出的荧光强度实时检测，并结合相应的计算方法，从而得出待检测样品中目标基因的含量，实现了PCR由传统的定性到定量测定的转化[1-2]。1995年美国应用生物系统公司研制的首台荧光定量PCR仪使荧光定量PCR技术走向市场化，在医学、检验检疫等方面得到了快速的推广应用。

1.1.1 水解探针法：TaqMan荧光探针是特异性的寡核苷酸荧光探针，在两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收而检测不到荧光。在PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针降解使得荧光基团分离，释放出荧光信号。目标基因每扩增一次就会有一个荧光基团游离出来，从而实现荧光的逐步积累，进而进行PCR产物的定量测定。新型的TaqMan-MGB探针在3′端使用了无荧光的淬灭基团，本身不产生荧光，大大降低了本底信号的强度。同时3′端的小分子修饰基团使得探针的长度缩短，可将探针的Tm值提高10℃，对单碱基突变的检测灵敏性得到提高。TaqMan-MGB实时荧光定量分析法能够快速、准确地定量测定出目标基因，且灵敏度高，特异性强，干扰因素少。

TaqMan技术已经在病原体检测、鉴别，畜禽产品的检验、检疫以及疫苗效力的测定上得到了较为广泛的应用。如Dovas等[3]建立了对H5N1禽流感病毒的实时荧光定量PCR测定方法，适用于H5N1禽流感病毒的高通量检测，并可在临床对疫病进行快速检测、诊断与推广。曹伟伟等[4]通过对基因储存库中猪圆环病毒的基因序列进行比较后，设计出能够特异性检测猪圆环病毒Ⅱ型的引物，成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量检测方法，该方法特异性高，能够为PCV-2的防治提供快速的指导。何世成等[5]建立了采用双重荧光RT-PCR技术来鉴别小反刍兽野毒与疫苗毒的区分方法，该方法检测流程简单，重复性好，灵敏度高，节约成本，更为便捷，且可以将诊断时间缩短至1 h便可快速区别出野毒株和疫苗株，为小反刍兽疫的流行病学调查、感染监测和疫苗评估提供快速有力的依据。

1.1.2 杂交探针法：分子信标探针的本质是茎环双标记寡核苷酸探针，所标记的荧光基团和淬灭基团因两端的核酸互补配对而紧紧靠近。在PCR扩增过程中，模板通过与特异性靶序列杂交而发生构象变化，使得荧光基团与淬灭基团分开。荧光基团被激发后，发出激发光子，荧光强度随着扩增产物的增加而积累，通过荧光仪的检测进行基因的定量分析。分子信标技术目前已用于单核苷酸多态性检测、病原体检测等生物医学和临床研究领域。McKillen等[6]建立的分子信标荧光定量PCR技术能够快速鉴别非洲猪瘟（ASFV）病原体，对于目标基因最低可检测到2×101的复制。该方法能够在同一个反应过程中通过不同的荧光探针进行多目标的检测，如同时快速、灵敏地进行猪圆环病毒2型（PCV2）与猪细小病毒（PPV）的鉴别测定，为正确实施疫病防控措施提供了有效保障。

罗氏公司开发的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）探针又称为双杂交探针，或者LightCycle探针，由2条和模板互补且相邻的特异探针组成，是距离很近的2个荧光分子间产生的一种能量转移现象。FRET探针复性时，2条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信号；升温变性时，两探针游离，两基团距离较远而检测不到荧光信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，可以进行熔解曲线的分析，还可以用于突变分析以及产物鉴别。此外，采用2条模板特异的探针，在检测过程中不受非特异性产物的影响，因而专一性更高于传统的PCR检测方法。欧盟的合作实验室利用FRET技术建立了同时检测口蹄疫所有7种血清型的定量实时RTPCR，测定灵敏度高，准确性高。1.1.3 荧光引物：Amplifluor技术的基本原理是激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性Amplifluor引物包含一个5′内部互补序列，标记有荧光发色团和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。3′端序列是目标特异性引物区，Amplifluor引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。在PCR扩增循环过程中，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。根据扩增循环中产生的荧光信号的强度与扩增产物的量进行定量分析。

由Invitrogen公司建立的LUM（light upon extention）技术采用类似分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。该技术不需要专门设计探针，因此可以节约成本，同时为实验设计提供了宽松的条件。李军等[7]设计的荧光双链引物是利用2条完全互补的寡聚核苷酸杂交形成的双链结构，将其中一条用于标记PCR扩增的引物，称为“正引物”，另一条与正引物完全互补，称为“负引物”。该方法应用于鸡新城疫的检测，成本低、特异性与重复性好，并能够准确定量样品中的基因拷贝数，在临床诊断、出入境检验检疫中有着广阔的应用前景。

1.2 基因芯片技术

20世纪80年代末，采用杂交法测定核酸序列的想法被提出，经过生物医学基础学科的快速发展，使基因芯片技术得到了推进与应用。基因芯片技术是建立在基因探针和核酸杂交技术之上，利用PCR技术制备检测模板，采用原位合成或显微点样技术将大量核酸片段探针有序地固化于支持物表面，然后与标记的待检测靶基因片段杂交，通过对杂交信号的强度与分布进行检测和分析，从而获得样品的基因序列、含量、基因表达等。高密度基因芯片可以预先设计大量探针固定于载体上，同时对成千上万个样品进行检测，实现样品的高通量检测，缩短了实验进程，提高了检出率。在统一设置的条件下，设置多种荧光标记探针，对多个样品同时分析，减少了外界因素的干扰，从而提高检测的准确性。此外，基因芯片技术可以实现实时、快速的全自动检测分析和高精密度、高灵敏度分析。

秦智锋等[8]利用 39个目的片段，同时加入λDNA作为坐标基因制备的基因芯片，可对临床上症状相似的4种水疱性疾病进行快速大批量的鉴别诊断。杨素等[9]利用分子克隆的方法分别获得口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段，将其固化在包被过的玻璃片上，制备成检测芯片，实现了对该5种病毒的快速有效诊断。该方法检测效率高，特异性强，灵敏度高，可应用于对多种动物传染病的大规模筛检、快速检测和鉴别诊断，尤其是可用于进出境动物检验检疫。此外，基因芯片技术还被应用于细菌分型的鉴定及耐药性的测定[10]。基因芯片技术有高通量、多参数、高灵敏度与自动化的优点，但同时由于设备昂贵、基因芯片技术标准化、成本高，以及待测靶探针标记方法繁琐等问题，目前其在动物疫病检测方面的应用还受到一定的制约，随着技术的不断完善和成熟，检测设备低廉化以及操作程序简约化，将来会为动物疫病检测带来更大的飞跃。

1.3 核酸恒温扩增技术

核酸恒温扩增技术是将PCR扩增反应过程进行恒温控制的一种新型扩增技术。相对于传统的PCR技术，该反应对仪器设备的要求简化，同时反应时间大幅缩短，反应结果肉眼可见。由于该技术潜在的巨大应用前景促使了多种不同形式的恒温扩增技术的产生。

2000年 Notomi等[11]建立了环介导恒温扩增法（LAMP），通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列。LAMP在反应过程中，能够产生大量的白色焦磷酸镁沉淀，而且可以通过焦磷酸镁沉淀的产生量与DNA生成量之间的线性关系，对整个反应进行定量。Dukes等[12]采用RT-LAMP方法快速检测口蹄疫病毒，能够在22 min内便可得到检测结果，且可以检测到仅10个拷贝的口蹄疫病毒。Imai等[13]利用RTLAMP建立了针对H5亚型的高致病性禽流感病毒的检测方法，该方法的敏感性是传统PCR的100倍。Chen等[14]建立了对猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP检测方法，与RT-PCR检测手段相比，该方法更灵敏、更可靠、更便捷。

Compton[15]于 1991 年在 PCR 技术基础上提出了核酸扩增技术（NASBA），目前该技术已经相对成熟地应用于病原体与基因异常的检测、动物疫病诊断等领域当中。Collins等[16-18]所建立的NASBA技术可以对口蹄疫的血清型进行检测，且实现了H7型禽流感的快速检测，并通过改良使其能够鉴别出高致病性禽流感和低致病性禽流感。我国2004年发布的系列标准GB/T 19439—2004《H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法》和GB/T 19440—2004《禽流感病毒NASBA检测方法》均采用NASBA检测方法对禽流感病毒进行测定。

此外，建立在恒温扩增基础上的还有切口酶核酸恒温扩增技术 （NEMA）、转录酶扩增技术（TMA）、链置换扩增技术（SDA）、滚环扩增技术（RCA）、解旋酶扩增技术（HDA）、实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）等，这些技术因存在成本高等问题，目前还处于研究阶段。相信随着仪器设备的升级、成本的降低、技术的完善，这些技术将会更便捷地应用于动物疫病的检测中。

1.4 其他分子诊断技术

随着学科的交叉，分子生物学的日新月异，越来越多的新技术与PCR技术进行结合，建立了实用效果越来越好的检测技术，并已经应用到动物疫病的检测当中。

2010年马艳琴[19]建立了PCR-斑点杂交技术，设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针，应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测，相对于套式PCR法，敏感性更好，检出率提高了10%。程安春等[20]建立了原位PCR（ISPCR）技术，对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒（DEV）核酸进行定位，该方法直观、敏感、特异性强，在显示核酸阳性信号的同时，还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。杨利峰等[21]将PCR与免疫学技术联用，建立了猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法，克服了组织样品中猪瘟病毒含量少而难以检测的困难，为猪瘟的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。不同病原体诊断技术的相互联用，进一步提升了诊断的准确性，为临床疫病的确诊与防治提供了决策依据。

2 新型分子诊断技术的发展趋势与前景展望

动物疾病检测的快速有效性在临床疫病的防控中起着非常重要的作用。传统的分子诊断技术，如核酸杂交技术、限制性酶切技术、核酸片段多样性分析等，存在操作步骤繁琐、周期长、成本高、有假阳性或假阴性结果呈现等缺点，在动物疫病诊断中的应用受到了一定的限制。随着分子检测技术的不断进步，近年来建立在PCR技术基础上的新型核酸诊断技术，具有敏感性高、特异性强、操作简便、诊断快速等优势，已经越来越多地被应用于动物疫病的检测当中。

多重荧光PCR和生物芯片技术等技术实现了一次反应同时检测多种病原的高效检测，适用于混合感染和未知感染的筛查和快速诊断。随着核酸提取、加样检测和分析等环节仪器装置的自动化研制，使得样品的处置量、提取的稳定性和自动化程度提高。随着仪器设备的研发，检测成本的降低，技术成熟度的提高，适用于基层和现场使用的检测技术将成为动物疫病检测的一个发展趋势。同时，结合其他的诊断技术，更多新型诊断方法使检测的样品数量和病原体种类更多，涉及领域也会不断增加，动物的疫病检测诊断将会更加快速、准确、全面。现代分子诊断技术不仅仅用于临床诊断和鉴别诊断，其具有高通量、自动化、精密化等特点，在大范围的流行病学调查和分析方面也能够发挥巨大的优势，为动物疫病的传播范围和传播途径的研究提供支持，从而为动物疫病的科学防控奠定基础。

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