活性氧对高原性肺动脉高压的影响

张国振 综述 何庆,2 审校

(1.西南交通大学医学院，四川 成都 610036； 2.西南交通大学附属成都市第三人民医院，四川 成都 610036)

肺动脉压力≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)称之为肺动脉高压(HPH)，高原上低氧诱导的HPH发生概率远大于其他HPH，长期的HPH也会引起肺水肿、右心室衰竭甚至死亡等严重后果。肺血管收缩反应增强、肺血管结构重建、肺血管内皮细胞对肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)运动和生长状态调制的异常，则是HPH变化特征的重要成因之一。近年来揭示这种复杂的病变可能包括多种细胞类型，包括内皮细胞、PASMCs等，它们在体内作为重要的调节组织维持着肺动脉压的稳态。而活性氧(ROS)也同时参与了内皮细胞和PASMCs对于肺动脉压的调控。有证据表明，高原环境下带来的低氧诱导了ROS的过载[1]，过载的ROS通过改变肺血管细胞增殖和细胞内信号传导途径来促成HPH[2]。目前研究表明ROS过载的主要来源为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH氧化酶，即NOX)和/或线粒体。现简要综述ROS参与肺动脉压调控的主要方式及作用机制。

1 ROS的定义和生理功能

氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质称ROS，它们包括超氧负离子自由基、过氧化氢和羟基自由基，它们一旦产生，可以相互转化，发生连锁反应。存在于生物体内活跃的ROS可用电子自旋共振仪测定。在生理情况下，ROS的生成与清除处于动态平衡，ROS可维持于有利无害的极低水平。由于内源性和/或外源性刺激使机体代谢异常而骤然产生大量ROS，或机体抗氧化物质不足从而使得促氧化剂/抗氧化剂间平衡失常，则使机体处于氧化应激状态，可氧化损伤生物分子，并进一步引起细胞死亡和组织损伤。同时ROS可作为细胞内重要的第二信使，在细胞基因调控、细胞信号传导过程中发挥着重要的生理功能。ROS通过影响细胞内Ca2+稳态、蛋白质磷酸化和信号的级联传递、转录因子的激活等细胞信号传导过程中的多个靶位点，调控细胞信号的传导，产生细胞生物学效应，如参与细胞生长、凋亡。

2 ROS的来源

目前普遍的看法是ROS大多来源于NADPH氧化酶和/或线粒体，包括过量的ROS可以迅速提高线粒体内膜的渗透性，即线粒体的渗透性过度，从而导致线粒体潜在的去极化[3]；但确切的氧感应机制以及ROS是否引起低氧性肺血管收缩(HPV)增加或减少的问题正在争论中。ROS可通过与蛋白激酶、磷脂酶、肌质钙通道、瞬时受体电位通道、电压依赖性钾通道和L-型钙通道的直接或间接相互作用诱导细胞内钙增加和随后的PASMCs收缩，其相关性可能在不同实验中并不完全一样[4]。

NOX(即NADPH氧化酶)是通过将电子从NADPH转移至分子氧，快速转化为过氧化氢的一组超氧阴离子生成酶。NOX家族有7个成员，包括NOX1～NOX5、双氧化酶1和双氧化酶2。最近的研究表明，NOX亚型在不同类型的HPH中可能具有不同的功能。评估来自HPH和非HPH患者和缺氧暴露的人肺动脉内皮细胞的肺组织标本的mRNA和蛋白质表达。使用细胞色素和荧光试剂测定来测量ROS。研究结果首次证实，与非HPH患者相比，HPH耐药血管中转录和蛋白水平的NOX1表达上调[5]。然而在从SD大鼠的外周血中分离内皮祖细胞并使其经受缺氧(氧气含量与氮气含量与二氧化碳含量比值为1∶94∶5)24 h试验中表明，低氧处理促进了内皮祖细胞的衰老和凋亡，伴随着内皮祖细胞的功能降低(黏附、迁移和血管生成能力下降)，以及NOX2和NOX4表达的增加，NOX活性的增强和过氧化氢产生的增加，这些现象被NOX抑制剂减弱[6]。虽然目前无法确切了解NOX与ROS相关的家族成员，但其衍生的ROS是参与促进肺血管重构过程的关键因素。

另外一种观点是线粒体电子传递链是ROS的主要来源，线粒体ROS可以特异性地增加蛋白激酶C-ε的活性，激活NOX，然后诱导更多的ROS产生(即ROS诱导的ROS产生)。线粒体ROS产生主要由复合物Ⅲ中的Rieske铁硫蛋白介导[7]。也有研究表明：线粒体电子传递链的复合物Ⅲ和复合物Ⅳ处氧感应的发生增加了肺动脉PASMCs中ROS的产生[8]。有人提出，在新生儿的PASMC中，缺氧抑制ROS的产生并减少氧化还原对的生成，从而抑制氧敏感的电压门控钾通道、去极化质膜、激活电压门控钙通道，增加细胞内Ca2+浓度，并引起血管收缩[9]。然而大多数人还是认为ROS的增加引起细胞内Ca2+浓度升高，从而导致HPV和相关的HPH。

3 ROS过载引发HPH的机制

目前研究ROS的过载主要还是基于上述的两个观点，由于低氧诱导增强了ROS的分泌来源，引起了HPH。Chandel等首先证明了线粒体ROS信号在缺氧条件下控制基因转录，随着科学研究的发展，各项假说与实验不断完善低氧诱导下ROS增加的相关机制，接下来将简述最新的一些假说及其证据。

Weise-Cross等[10]提出的假说是：慢性低氧通过ROS生成和RhoA/Rho激酶(ROCK)至依赖性肌丝Ca2+致敏增强基础和内皮素-1(ET-1)诱导的肺血管收缩反应。为了测试慢性低氧是否直接改变动脉肌动蛋白谱，通过荧光标记固定肺动脉中的F-肌动蛋白和G-肌动蛋白以及通过肌动蛋白沉降测定肺动脉溶解产物来测量丝状(F)和球状(G)肌动蛋白比率。通过免疫印迹最终得出结论：肌动蛋白聚合有助于以ROS-、ROCK-依赖性方式增加慢性低氧后的基础肺动脉收缩和ET-1诱导的血管收缩的反应性。肌动蛋白解聚因子丝切蛋白家族是一类肌动蛋白结合蛋白，广泛存在于真核细胞体内。慢性低氧后增强的ET-1介导的肌动蛋白聚合依赖于mDia(RhoA效应物)，但与磷酸化丝切蛋白/总肌动蛋白解聚因子丝切蛋白的比值变化无关。

Wu等[11]认为ROS、缺氧诱导因子(HIF)和钾通道(Kv)被认为是HPH发展过程中的主要因素，他们提出“ROS/Kv/HIF轴”可能在HPH的发展中起到重要的启动作用，ROS在低氧条件下形成，影响HIF或Kv的表达和功能，并因此触发多个参与促进肺血管收缩和动脉重构的下游信号传导途径和基因表达。首先，缺氧导致肺内小动脉ROS的剧增。增加的ROS会抑制Kv在肺动脉的活动，同时ROS也会抑制脯氨酸羟化酶的生成稳定HIF活动。Kv活性降低可以解释缺氧暴露下早期的肺血管收缩反应。另一方面，稳定的HIF轴可以激活其下游基因，进而引起HPH中参与肺血管重构的各种缺氧相关蛋白的表达。上述这些因素进一步导致了肺血管收缩/扩张和增殖/凋亡的不平衡，最终促进了HPH的发展。

最后还有阴离子交换学说，Mansoori等[12]认为细胞膜中没有超氧阴离子的特殊转运蛋白，它可能通过阴离子交换剂从细胞中释放出来；因此，通过家兔实验研究ROS和阴离子交换剂在急性HPV中的相互作用，通过灌流液处理分离的兔肺，最终Trolox(抗氧化剂)和Trolox+DIDS(阴离子交换剂抑制剂)组都消除了HPV。 Trolox+DIDS组的NO代谢物浓度高于其他组。表明急性HPV中ROS和阴离子交换剂之间可能存在相互作用。这也提示了NO在上述条件下的调节作用。然而在Jernigan等[13]操作的大鼠肺动脉的抗氧化治疗模型中。研究结果虽然支持ROS在介导血管收缩反应性增强和HPH中的主要作用，然而在慢性缺氧的大鼠模型中，抗氧化剂疗法在缺氧时严重HPH动物中加重动脉重构。同样的，在Chen等[3]关于肺动脉PASMCs特异性凋亡是否参与了复氧诱导的低氧性肺动脉重构逆转的实验中，发现体外实验下重建肺动脉的逆转与过氧化氢增加和标本切割的caspase 3/PARP、Bax和Bcl-2的改变相关，复氧可诱导培养的大鼠初代PASMCs凋亡，伴随着线粒体ROS增加，线粒体功能障碍以及细胞色素C从线粒体释放到细胞质。ROS的清除减轻了线粒体功能障碍以及细胞色素C的释放，并最终降低了PASMC凋亡。即复氧诱导的PASMCs凋亡与缺氧性肺动脉重构的逆转有关，这可能与线粒体ROS介导的线粒体功能障碍有关。是否可以猜想，非严重的HPH可能存在缓解甚至是逆转重构的可能，然而严重的HPH经过抗氧化治疗后情况反而会加重，这其中的机制还有待发现和进一步阐明。

之前还有研究表明ROS是第二信使分子，其通过可逆地氧化关键靶蛋白的特定氨基酸残基来调节细胞功能[14]。主要表现血管平滑肌对G蛋白偶联受体刺激的收缩反应以及肺动脉中的缺氧显示出依赖于ROS和Src家族激酶活性。影响活性的特定磷酸化靶点由于细胞内变化的Ca2+浓度被识别。，而Ca2+浓度的调节主要受到的影响包括瞬时受体电位通道、电压门控通道和各种类型的K+通道，以及那些调节肌动蛋白细胞骨架动力学和肌球蛋白磷酸酶活性，包括黏着斑激酶、蛋白酪氨酸激酶-2、Janus激酶，其他黏着相关蛋白和Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子。

4 触发ROS增加的相关小分子

至今，ROS的研究已证实了与ROS相关的细胞分子和基因包括：线粒体氧化还原调节剂硫氧还蛋白2、氧化低密度脂蛋白受体-1以及DRP1(GTP酶)。在这些分子中，硫氧还蛋白2的体外过表达减少了低氧诱导的过氧化氢的产生[2]。Zhu等[15]发现缺氧引起大鼠右心室和心肌细胞(H9C2细胞)中的显著氧化应激，减少氧化低密度脂蛋白受体-1可以显著减弱H9C2细胞氧化应激。Zhang等[16]观察到缺氧诱导的DRP1表达依赖于ROS产生，特别是线粒体ROS。此外，低氧引起的ROS和线粒体ROS水平受DRP1调节。

5 讨论

目前认为缺氧诱导下线粒体和NADPH造成了ROS的增加影响着HPH，事实上，并不排除其他来源的可能性。目前关于ROS的相关机制很多尚不清晰，尽管很多研究做出了ROS相关的散在影响分子，这些分子以直接或间接的形式对ROS造成影响，甚至引起了基因表达的改变，却无证据表明直接与ROS相关。目前认为ROS参与低氧诱导HPH主要是：慢性低氧通过ROS生成和ROCK至依赖性肌丝Ca2+致敏增强基础和ET-1诱导的肺血管收缩反应假说，“ROS/Kv/HIF轴”假说以及可能的阴离子交换学说。虽然其中关于ROS的作用阐述得较为系统全面，但可能并不完全，仍需进一步研究。