巨噬细胞自噬在动脉粥样硬化中作用的研究进展

密泗宇，周　影，王静巧，童茂清*，陈晓敏*

(1.宁波大学 医学院，浙江 宁波 315000；2.宁波市第一医院 分子实验室，浙江 宁波 315000；3.宁波市第一医院 心内科， 浙江 宁波 315000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的主要病变特征是血中脂质在动脉内膜沉积、平滑肌细胞和结缔组织增生，引起内膜灶性纤维性增厚及粥样斑块形成，进而使动脉壁变硬，管腔狭窄。AS仍然是发达国家和许多发展中国家死亡的主要原因，预计到2020年，心血管疾病，特别是AS，将成为全世界疾病主要死因之一。巨噬细胞在AS的起始和发展具有重要作用，巨噬细胞可分泌炎性细胞因子，诱导更多单核细胞进入血管内膜并促进巨噬细胞增殖。氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)衍生的胆固醇外流受到破坏，随后脂质在巨噬细胞积累是动脉粥样硬化形成中的标志事件[1]。当脂质过载， 超过巨噬细胞的代谢能力时，巨噬细胞内聚集大量脂质， 促进血管内膜生长与坏死核的形成，增加斑块破裂的风险。与此同时，巨噬细胞转化为泡沫细胞。泡沫细胞清除率降低以及泡沫细胞凋亡进一步激活炎性反应，还参与活性氧中间产物[2]合成或分泌，加剧斑块内毒性环境的危险因素(包括坏死与凋亡细胞的碎片、组织缺氧和脂质)的积累。巨噬细胞自噬作为一种代偿机制，对减轻上述因素对斑块的不良影响具有重要意义。

本文系统回顾有关巨噬细胞在AS发病中的作用机制，尤其是巨噬细胞自噬在AS中的作用。

1　动脉粥样硬化的发病机制

动脉粥样硬化是内皮损伤引起血流紊乱等一系列反应，先是血小板的黏附，然后巨噬细胞渗透到内皮下，引起炎性反应、氧化应激、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)氧化和平滑肌细胞增殖，继而产生动脉管壁中的瘢痕。目前确定的风险因素包括高血压、吸烟、高脂饮食、升高的LDL、糖尿病和左心室肥大(基本反映近年来血压的积分)[3]。

动脉粥样硬化斑块的发展分为4个阶段：脂肪条纹；动脉粥样化斑块；复杂的动脉粥样硬化斑块和临床病理学的并发症，其中，复杂的动脉粥样硬化斑块，其特征在于泡沫细胞的聚集和薄的纤维帽，已被普遍认为是不稳定的斑块。这些斑块的破裂被认为是急性心血管事件的主要原因。

动脉粥样硬化的具有不规则动脉管壁综合征，是导致各种心血管疾病发展的主要原因之一。动脉粥样硬化的关键起始因素是胆固醇积聚。不受控制的胆固醇沉积主要是LDL[4]，引起粥样斑块形成，其由于炎性细胞例如巨噬细胞的募集而引发慢性炎性反应。巨噬细胞清除过量的外周胆固醇并将细胞内胆固醇转化成高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)用于排泄或储存。巨噬细胞摄取过量的胆固醇而转化成泡沫细胞是动脉粥样硬化形成的主要原因[5]。

2　巨噬细胞、自噬与动脉粥样硬化

2.1　巨噬细胞概述

动脉粥样硬化是一种慢性炎性反应，其中巨噬细胞发挥重要的作用，积极参与胆固醇积聚，在动脉壁中积聚成泡沫细胞。巨噬细胞群体具有异质性，他们由功能和基因表达谱不同的几种细胞亚型组成。促炎性巨噬细胞诱发斑块沉着和进展，而抗炎巨噬细胞参与斑块稳定，可以减少单核细胞募集至损伤部位，抑制促炎性巨噬细胞或刺激抗炎反应和胆固醇流出。巨噬细胞在动脉粥样硬化的发病机制中起核心作用[6]。

2.2　巨噬细胞自噬与动脉硬化

在动脉斑块缺氧区，在缺氧诱导因子1α作用下，可增强巨噬细胞的炎性反应，并促进动脉粥样硬化的进展[7]。受体相互作用蛋白140，可通过减少反向胆固醇转运基因，ATP结合膜盒转运蛋白A- 1(ATP-binding cassette subfamily G member 1, ABCA1)，ATP结合膜盒转运蛋白G- 1(ATP binding cassette sub-family G member 1, ABCG1)的表达，促进巨噬细胞转化成泡沫细胞。因此减少巨噬细胞中缺氧诱导因子1α的水平，显着抑制动脉粥样硬化[5]。

自噬是降解功能障碍蛋白和细胞器的分解代谢细胞机制。动脉粥样硬化斑块形成在具有缺乏关键自噬蛋白(autophagyrelated gene5，ATG5)巨噬细胞的小鼠中增强，表明p62富集的蛋白质聚集体是动脉粥样硬化的特征。巨噬细胞特异性消融的ATG5和p62缺陷进一步增加小鼠动脉粥样硬化斑块负荷，表明p62可隔离细胞毒性泛素化蛋白，保护血管以免形成动脉粥样硬化[8]。可见巨噬细胞参与的炎性反应和泡沫细胞的形成，巨噬细胞的自噬过程以及相关分子的调控，在动脉粥样硬化中起到重要作用。

3　巨噬细胞自噬：促进脂质代谢并参与动脉粥样硬化中炎性反应信号的传导

巨噬细胞在动脉粥样硬化免疫应答中发挥着重要作用,巨噬细胞自噬作为动脉粥样硬化新的参与者也获得普遍共识。巨噬细胞自噬是由溶酶体系统降解胞内受损、变性及衰老的蛋白质与细胞器的过程,基础水平的自噬可保护细胞免受环境刺激影响,对于控制动脉粥样硬化进程具有重要意义,反之过度自噬则导致细胞死亡,斑块失稳[2]。通过沉默ATG5或其他自噬介质抑制自噬，增强凋亡和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶介导的氧化应激，同时使得凋亡细胞不太被泡沫细胞很好地识别,从而促进斑块坏死和泡沫细胞恶化。

3.1　自噬及其主要调控蛋白

自噬是真核生物中一种进化上高度保守的、用于降解和回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的过程[9]。自噬大致被分为以下3种: 宏自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)。目前, 对自噬的研究主要集中在宏自噬, 其机制也最为清楚, 常被人们狭义地等同为细胞自噬[10]。

自噬发生需要经过以下几个阶段: 自噬前体形成; 自噬前体延长包裹自噬的底物, 自噬泡形成; 自噬泡与溶酶体融合完成底物降解。在自噬发生的整个过程中涉及许多自噬相关蛋白，被称为自噬相关蛋白 (autophagyrelated gene，Atg)。到目前为止，已经在酵母中发现了34种Atg蛋白`。根据其参与自噬发生的不同阶段, 这些核心的自噬蛋白被分为5类: Atg1/ULK1蛋白激酶复合体、Vps34-Atg6/Beclin1和Ⅲ型PI3K复合体；Atg9/mAtg9；Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统[11]。自噬调控的中心分子TOR是控制细胞自噬的关键蛋白, 能感受细胞的多种变化信号, 加强或降低自噬的发生水平。细胞内ATP水平、缺氧等细胞信号都可直接或间接通过TOR将其整合, 从而改变细胞的自噬发生, 应对不同的外界环境刺激。AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)是细胞中感受能量状态调节代谢的1个蛋白激酶, 在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用[12]。

自噬启动ATG1激酶蛋白(unc- 51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)是自噬信号通路唯一1个具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的核心蛋白。ULK1 复合物在体内是连接上游营养或能量感受器 mTOR 和 AMPK 与下游自噬体形成的桥梁。磷酸化的 ULK1 一直以来都被认为是自噬的一个关键调控因子[13]。Ⅲ 级 PI3K 复合体，包括了 hVps34、Beclin- 1 (酵母 Atg6 的哺乳动物同源物)、p150 (酵母 Vps15 的哺乳动物同源物) 和 Atg14-like 蛋白 (Atg14L 或 Barkor) 或 抗紫外线照射相关基因，都是自体吞噬诱导所需要的[14]。Atg 基因通过 Atg12-Atg5 和 LC3-Ⅱ (Atg8-Ⅱ) 复合物控制自噬体的形成。自噬体中 LC3 的存在，及其向低迁移形式的 LC3-Ⅱ 的转化被作为自噬发生的“指示器”。

3.2　巨噬细胞自噬对胆固醇流出和泡沫细胞形成的影响

对于早期泡沫细胞，用自噬激活物雷帕霉素治疗显着降低细胞内脂质含量并防止它们转变成泡沫细胞，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤显着增加细胞内脂滴累积[15]。在泡沫细胞发育过程中，上调自噬不仅减少细胞内脂滴积累，还通过清除功能失调的线粒体和降低细胞内活性氧水平来抑制细胞凋亡。巨噬细胞形成泡沫细胞的命运与自噬相关。早期自噬增强抑制巨噬细胞形成泡沫细胞，并预防动脉粥样硬化[16]。

脂滴是巨噬细胞泡沫细胞中胆固醇储存的主要部位，并且是治疗动脉粥样硬化的潜在治疗靶标[15]。作为胆固醇酯存储的胆固醇从该细胞器释放并递送至胆固醇受体。目前的研究将所有细胞质胆固醇酯水解归因于中性胆固醇酯水解酶的作用。然而，除了中性水解酶，溶酶体在胆固醇负载巨噬细胞中水解脂滴和胆固醇酯具有重要作用。此外，脂滴通过自噬传递到溶酶体，其中溶酶体酸脂肪酶水解脂滴和胆固醇酯产生游离胆固醇主要是靠ABCA1依赖性流出，这个过程是在巨噬细胞胆固醇负载时特异性诱导的。因此，在巨噬细胞泡沫细胞，溶酶体水解有助于动员脂滴相关胆固醇逆向胆固醇运输[17]。长期用3-甲基腺嘌呤治疗可促进氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞自噬并体外抑制泡沫细胞形成和细胞活力。此外，系统应用3-甲基腺嘌呤促进脂滴分解和减少凋亡，最可能与自噬相关[18]。骨髓移植实验表明造血细胞中程序性细胞死亡介导的自噬促进动脉粥样硬化的发展，因而下调程序性细胞死亡4的表达促进巨噬细胞自噬可能有益于治疗动脉粥样硬化[19]。

氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞溶酶体膜的损伤，然后导致溶酶体内容物的渗漏和巨噬细胞死亡。胆固醇氧化产物是氧化低密度脂蛋白/低密度脂蛋白的主要细胞毒性成分，并且也刺激血管细胞中的胆固醇积聚。巨噬细胞暴露于胆固醇氧化产物后12 h发现增强的自噬和染色质边缘化，而在暴露后24 h和48 h，发生凋亡和凋亡后坏死。在暴露于胆固醇氧化产物24 h后锰超氧化物歧化酶mRNA显着增加，表明线粒体诱导保护修复。因此胆固醇氧化产物诱导损伤的溶酶体和线粒体是后续的氧固醇细胞毒性事件的级联反应。由胆固醇氧化产物诱导的溶酶体的早期破坏，导致自噬吞噬作用可能是在动脉粥样硬化病变发展期间巨噬细胞/泡沫细胞凋亡和/或坏死的关键事件[20]。

4　巨噬细胞自噬、炎性反应和氧化应激

巨噬细胞的自噬、炎性反应和氧化应激有诸多联系。巨噬细胞表达Toll样受体识别病原体并通过诱导自噬消除细胞内病原体[21]。咪喹莫特诱导巨噬细胞自噬，通过细胞因子释放和增强炎性反应细胞浸润刺激斑块进展。球状脂联素通过腺苷5’-单磷酸激活蛋白激酶通路和抑制AngⅡ诱导的炎性反应激活巨噬细胞自噬，从而减少心脏纤维化的程度[22]。芹菜素诱导凋亡和下调肿瘤坏死因子α，白介素- 6和白介素- 1β的分泌。芹菜素诱导脂质巨噬细胞凋亡和控制炎性反应，以改善动脉粥样硬化，芹菜素与自噬抑制的联合可能有益于诱导泡沫细胞凋亡和调节动脉粥样硬化细胞因子[23]。促炎细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子在应激条件下维持心脏稳态中起作用。巨噬细胞迁移抑制因子敲除加剧了老化引起的心脏中不利的结构和功能变化，巨噬细胞迁移抑制因子敲除的有害作用与伴随衰老的心脏自噬的加重损失有关。有趣的是，衰老诱导的不利反应被自噬诱导雷帕霉素治疗逆转[24]。

活性氧是自噬的上游调节器，氧化应激加上有缺陷的自噬可能在调节动脉粥样硬化斑块发展中发挥根本作用。基础自噬可以通过降解受损的细胞内物质和促进细胞存活来保护斑块细胞免受氧化应激。与基底自噬相反，过度刺激平滑肌细胞和/或内皮细胞中的自噬可导致自噬细胞死亡，导致胶原合成减少，纤维帽变薄，斑块不稳定，病变血栓形成和急性临床事件[25]。

5　问题与展望

自噬的领域在过去十年中已经飞速发展。新兴数据支持巨噬细胞自噬在动脉粥样硬化的发病机制中发挥突出作用。目前已经进行了许多基础和临床研究，通过靶向自噬过程来治疗动脉粥样硬化。

展望未来，仍有些未解决的问题。自噬机制的各种蛋白与除自噬体形成之外的途径相关，如所谓的LC3相关吞噬作用与清除率相关的细胞坏死和细胞凋亡作用。虽然目前还不知道LC3相关吞噬作用是否与动脉粥样硬化相关，但需要关注吞噬和自噬在动脉粥样硬化巨噬细胞之间的相互作用。斑块中巨噬细胞受到不断增加的胞内脂质积累以及受损的细胞器和错误折叠/聚集的蛋白质，越来越明显的是，通过使用衔接蛋白(例如p62/SQSTM1)，细胞保留了经历“选择性”而不是大量自噬的能力。