微粒体谷胱甘肽S转移酶1过度表达促进肝癌发生发展

蔡　培，黄富强，赵　齐，周　贤，杨华瑜，毛一雷，张宏冰*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生理学系, 北京 100005;2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 肝脏外科, 北京 100730)

中国肝癌发生率和病死率占世界肝癌总发病和总死亡的50%[1]，肝癌发病率居中国所有癌第4位，致死率居第2位[2]。目前手术切除仍是治疗肝癌的首选，有效治疗肝癌的药物依旧匮乏。因此，研究肝癌发生的分子及病理改变有利于深入了解该疾病，找到有效的治疗靶点。研究表明，微粒体谷胱甘肽S转移酶1(microsomal glutathione S-transferase 1, MGST1)在人肺腺癌和鱗状细胞癌、骨癌、急性髓性白血病和胶质母细胞瘤等[3-6]多种癌中表达上调，然而其与肝癌的关系尚不清楚。本研究发现，人肝癌组织中MGST1蛋白表达高于癌旁组织，在不同的肝癌细胞系中敲低和过表达MGST1后，探讨其对肝癌细胞增殖、迁移和肝癌发生发展的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物和组织标本：SPF级4～6周(质量为10～14 g)BALB/c-nu雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)(合格证号为：11400700262195)；原发性肝癌病例标本(由北京协和医院肝胆科提供)，所有肝癌患者已签署知情同意书，本研究已获得北京协和医学院基础学院伦理委员会的批准书。

1.1.2细胞系：人肝癌细胞系MHCC97H和HCCLM3(复旦大学肝癌研究所)；HepG2、SK-Hep-1、Hep3B2.1-7和HEK293T(ATCC)；HepG2.2.15、Bel7402(北京大学人民医院肝病研究所)；慢病毒载体PLL3.7及其包装质粒(厦门大学尤涵教授惠赠)；慢病毒载体pCDH及其包装质粒(Addgene公司)。

1.1.3主要试剂：胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM培养基(Hyclone公司)；Trizol试剂(Sigma Aldrich公司)；ReverTra Ace qPCR RT Kit(东洋纺生物科技有限公司)；TransStart SYBR Green qPCR SuperMix及大肠杆菌感受态(北京全式金生物技术公司)；MGST1一抗(北京华兴博创生物技术中心)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；GAPDH一抗、兔抗和鼠抗的二抗(ABclonal公司)；HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ(TaKaRa公司)；Transwell小室(BD公司)。

1.2　方法

1.2.1敲低细胞株的构建：靶向人MGST1的序列由北京擎科生物技术有限公司合成。上游引物：5′-TGCCAAGAAGTATCTTCGAATTCAAGAGATTCGAAG ATACTTCTTGGCTTTTTTC-3′(含HpaⅠ酶切位点)；下游引物：5′-TCGAGAAAAAAGCCAAGAAGTATCT TCGAATCTCTTGAATTCGAAGATACTTCTTGGCA-3′(含XhoⅠ酶切位点)。将上下游引物与PLL3.7质粒载体经酶切连接后转化大肠杆菌Trans5a，测序鉴定正确后命名为pll3.7-shMGST1。将PLL3.7 shRNA及其包装质粒VSVG、REV、pMDL转入293T细胞中，转染后72 h经0.45 μm滤膜收集病毒液，用于感染MHCC97H和HCCLM3细胞系。感染效率可通过绿色荧光蛋白的表达初步判定。

1.2.2过表达细胞株的构建：人MGST1 CDS区由上海捷瑞生物工程有限公司合成。经酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ插入载体pCDH中，经测序鉴定正确后命名为pCDH-MGST1。将pCDH及其包装质粒psPAX2、pMD2G转入293T细胞中，转染后72 h经0.45 μm滤膜收集病毒液，用于感染SK-Hep-1细胞系。感染效率可通过绿色荧光蛋白的表达初步判定。

1.2.3实时定量PCR检测MGST1 mRNA的表达：Trizol 裂解提取细胞的mRNA，并按Tobybo公司的反转录说明书反转录cDNA。根据qPCR Mix的说明书设置反应体系及反应条件(引物序列见表1)。

表1　qPCR引物序列Table 1　qPCR primer sequence

1.2.4蛋白质免疫印迹检测MGST1蛋白表达：以含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞或组织，破碎后的样品于98 ℃金属浴中加热10 min，取50 μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶并转至PVDF膜上。以β-actin蛋白(细胞)和GAPDH蛋白(组织)的表达水平为对照。

1.2.5克隆形成：将6 000个MHCC97H和HCCLM3及2 000个SK-Hep-1细胞铺于10 cm培养皿中，MHCC97H细胞于铺完16 d、HCCLM3细胞铺完21 d、SK-Hep-1细胞铺完13 d弃去上清，PBS润洗，甲醇固定15 min，0.5%结晶紫染色15 min，拍照并统计克隆数目。每种细胞平行铺3个培养皿。

1.2.6Tranwell细胞迁移实验：将650 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基加入下室(培养板)，Transwell的小室置于细胞培养皿的孔中，上室加入200 μL的2.7×106个/mL无血清培养基的MHCC97H和HCCLM3细胞悬液以及2×105个/mL无血清培养基的 SK-Hep-1细胞悬液。培养24 h后，以4%甲醛溶液固定，结晶紫染色后观察细胞迁移情况。

1.2.7裸鼠皮下移植瘤实验：取100 μL浓度为1×107个/mL的MHCC97H shMGST1和shV的细胞悬液接种于5周左右的BALB/c-nu雌性裸鼠背部皮下，每组9只。接种后每2～3 d观察1次，待肿瘤出现后，隔日用游标卡尺测量肿瘤块最大直径(L)和最小直径(W)，以V=1/2×L×W2计算肿瘤的体积。测量并记录细胞在裸鼠中成瘤时间、肿瘤体积及裸鼠生存时间(肿瘤体积V>1 000 mm3时记为裸鼠死亡)。

1.3　统计学分析

2　结果

2.1　MGST1在人肝癌组织中高表达

在24对人肝癌组织中，MGST1蛋白在肿瘤内的表达高于瘤旁的有17对(70.83%)(图1)。

2.2　敲低及过表达细胞株中MGST1蛋白及mRNA的表达

人肝癌细胞系中MGST1均存在不同程度的表达，MHCC97H、HCCLM3细胞的MGST1蛋白相对表达量较高，SK-Hep-1细胞的相对表达量较低(图2A)。所以本课题在MHCC97H和HCCLM3细胞中敲低MGST1，在SK-Hep-1细胞中过表达MGST1。与对照细胞相比，MGST1敲低的MHCC97H和HCCLM3细胞中，MGST1蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.001)(图2B-C)；MGST1过表达的SK-Hep-1细胞中，MGST1蛋白及mRNA表达水平均显著上升(P<0.01)(图2D)。

2.3　MGST1对肝癌细胞克隆形成能力的影响

敲低MGST1抑制MHCC97H细胞(P<0.001)和HCCLM3细胞(P<0.01)的克隆形成能力，过表达MGST1促进肝癌细胞克隆形成能力(P<0.05)(图3)。

2.4　MGST1对肝癌细胞迁移的影响

敲低MGST1抑制MHCC97H和HCCLM3细胞迁移(P<0.01)，过表达MGST1可促进SK-Hep-1细胞迁移(P<0.01)(图4)。

T.human HCC tissues; N.adjacent tissues图1　人肝癌组织中肿瘤区域MGST1的表达高于瘤旁组织Fig 1　MGST1 was higher expressed in HCC tissues than adjecent liver tissues

A.expression of MGST1 in HCC cell line; B, C,D.expression of MGST1 protein detected by Western blot (up) and relative expression ofMGST1 mRNA detected by qPCR(down);*P<0.01,**P< 0.001 compared with control cells

2.5　敲低MGST1抑制肝癌细胞裸鼠成瘤能力

与对照组相比，MGST1敲低的MHCC97H细胞裸鼠成瘤时间滞后(P<0.01)，肿瘤体积减小(P<0.001)，并且生存期延长(P<0.001)(图5A-C)。

3　讨论

过去20年肝癌致死的病例持续上升。目前治疗肝癌的方法有：手术切除、肝移植手术、射频消融术、肝动脉栓塞术和索拉非尼[7]。然而大多数肝癌患者确诊于疾病进展期，只有索拉菲尼治疗可以轻度提高部分患者的生存期[8]。因此，继续深入研究肝癌，探索新的靶向基因以及药物十分必要。

MGST1在人体各器官广泛分布[9]。大量报道MGST1在多种癌中表达上调[3-6]，然而对MGST1在癌中发挥的具体作用研究甚少。本研究发现MGST1蛋白在70.83%的人肝癌样本中表达高于其癌旁组织。此结果与既往报道共同提示MGST1在癌发生发展中可能起着重要作用。利用慢病毒系统构建敲低和过表达MGST1的载体后，在低表达MGST1的SK-Hep-1细胞中过表达MGST1；在高表达MGST1的MHCC97H和HCCLM3细胞中敲低MGST1。克隆形成实验结果显示，敲低MGST1抑制细胞增殖及克隆形成能力，过表达MGST1促进细胞增殖及克隆形成能力。这一结果与MGST1在肺癌细胞中促进细胞增殖及克隆形成的生物学功能相似[10]。之前的研究表明MGST1高表达可能与癌侵袭转移相关[11]。为探讨MGST1对肝癌细胞迁移能力的影响，本研究检测了敲低及过表达MGST1后细胞迁移能力的变化。结果显示，敲低MGST1抑制细胞迁移能力，过表达MGST1促进细胞迁移能力。裸鼠移植瘤实验中，MGST1蛋白敲低的细胞裸鼠成瘤时间滞后，肿瘤体积减小，并且裸鼠生存期延长。这些结果提示MGST1过表达促进肝癌的发生发展。

A.MGST1 knockdown suppressed the colony formation of MHCC97H cells; B.depletion of MGST1 inhibited the colony formation of HCCLM3 cells; C.MGST1 over-expression promoted the colony formation of SK-Hep-1 cells;*P<0.05,**P< 0.01,***P< 0.001 compared with control cells

综合以上结果，本研究表明MGST1在半数以上肝癌样品中表达上调。MGST1可促进人肝癌细胞系的增殖、迁移。敲低MGST1抑制肝癌细胞在裸鼠成瘤和发展。因此，MGST1过度表达促进肝癌发生发展，可作为治疗肝癌的新靶点。

A.MGST1 knockdown inhibited the migration of MHCC97H cells; B.MGST1 silencing suppressed the migration of HCCLM3 cells; C.ectopic expression of MGST1 increased the migration of SK-Hep-1 cells;*P<0.01 compared with control cells

A.tumor free curve of nude mice transplanted with shV or shMGST1 MHCC97H cells; B.tumor volume was monitored after tumor initiation; C.survival curve of nude mice transplanted with shV or shMGST1 MHCC97H cells;*P<0.01,**P<0.001 compared with control group