依赖解旋酶的等温扩增技术在手足口病检测中的应用研究

王晓，唐美媛

（广西壮族自治区桂林医学院附属医院检验科，广西 桂林 541001）

0 引言

手足口病具有病情进展速度快、发病范围广以及负面影响大等诸多特点，并且近年来其上升趋势较为明显[1]，其中肠道病毒71型与柯萨奇病毒A16型在手足口病的暴发流行发挥了重要作用[2-3]，发病后因感染部位不一，严重程度也不相同，若病情控制不及时，会出现危及患儿生命的严重后果[4]。本研究对收治手足口病儿童EV71、CA16及HFMD其他EV病原各40例标本分别进行依赖解旋酶恒温扩增技术检测。

1 资料与方法

1.1 标本来源和数量

本次研究选取2014年6月至2015年12月医院收治的手足口病儿童（EV71、CA16及HFMD其他EV病原各40例）标本。按照《手足口病预防控制指南》进行检验标本的收集、储存以及转运等操作。排除临床资料不符合《实用儿科学》中诊断标准、不配合以及临床资料欠缺的患儿，患儿年龄最小的9个月左右，年龄最大的10.1岁。

1.2 标本采集和保存

根据不同检验标本选择所采集的时间。发病72h内针对患儿采集血液、疱疹液以及咽拭子标本。采集后的标本放-70℃冰箱保存。

1.3 仪器及方法

BSC-1500生物安全柜、K30干式恒温仪、2720PCR仪、HYDRASY2电泳仪。试剂是美国NEB公司RT-tHDA反应试剂盒。引物探针根据HDA技术要求从GenBank数据库EV、EV71和CA16序列。普通RT-PCR引物序列参照《手足口病防控指南》。通过建立RT-tHDA法进行检测，普通扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测判断结果。HDA扩增反应根据两步法以及一步法的效果，确定合适的反应程序。

1.4 技术方法评价

参照方法：普通RT-tHDA以普通RT-PCR方法作为参照进行评价。评价指标：特异性核酸扩增产物的酶切鉴定以及序列测定；利用EV71、CA16、其他型EV做阳性、诺如病毒、轮状病毒做阴性，检测确定其特异性。检测系列稀释的已知拷贝数的RNA以确定灵敏度，检测所有临床标本确定其符合率。

1.5 统计学方法

将所有标本的基本资料、研究数据均采用SPSS17.0软件进行分析。正态计量数据用“Mean±SD”表示，非正态数据采用Median（IQR），两组独立、正态、方差齐资料组间比较采用t检验；非正态分布的采用非参数秩和检验；多组独立，正态，方差齐资料组间比较采用单方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-tHDA的特异性

用RT-tHDA对EV71、CA16、HFMD其他EV、诺如病毒、轮状病毒样本进行检测，结果显示，用肠道病毒通用反应液检测EV、EV71、CA16均出现特异性扩增产物，具有典型的特异条带呈阳性，诺如病毒、轮状病毒及阴性标本没有特异性扩增产物呈阴性，用EV71反应液检测，EV71均出现特异性扩增产物，具有典型的特异条带呈阳性，CA16、诺如病毒、轮状病毒及阴性标本没有特异性扩增产物呈阴性，用CA16反应液检测，CA16均出现特异性扩增产物，具有典型的特异条带呈阳性，EV71、诺如病毒、轮状病毒及阴性标本没有特异性扩增产物呈阴性，检测结果具有较强的特异性。

2.2 RT-tHDA的灵敏度和符合率

将已知RNA原液稀释后检测其浓度，各标本的最低浓度为500copy/tude，具有较高灵敏度。临床标本通过RT-tHDA方法检测结果与RT-PCR法检测结果对比，阳性结果的符合率为91.28%～100.00%，平均为95.24%，阴性检测结果符合率为100.00%。

3 讨论

病毒感染性疾病目前是我国公共卫生领域具有挑战性的重要健康问题。临床早期诊断是手足口病治疗的第一道防线，手足口病主要是由EV71病毒或CA16病毒等多种病毒引起的，主要发生于学龄儿童，临床可通过早期诊断、早期治疗以及隔离等手段进行有效治疗[5-7]。RT-tHDA的作用机制为通过利用在早期诊断肠道病毒感染具有突出优势，RT-tHDA技术是模拟动物体内DNA的合成方式，是一种可在75～90min完成真正恒温下进行检测的一种技术，具有简便、高效的特点，与其他基因扩增技术相比，可在基层医院对手足口病进行快速检测提供早期诊断依据[8-10]。HDA作为新型的等温扩增技术，其中通过使DNA解旋酶解开DNA双链，其受解旋酶的解旋速度、结合以及延伸长度所需要，临床实际操作中模板靶序列超过400bp会使扩增效率明显降低，优质的DNA解旋酶决定了扩增效果。本次研究中通过建立RT-tHDA方法，证实了RT-tHDA检测法具有灵敏度高、特异性强的特点。

综上所述，通过建立RT-tHDA方法可在2h内完成检测工作，作为临床针对手足口病的快速检测方法可有效提供第一道防护屏障，经济适用性高以及对设备要求低，在基层医院较为适用，值得临床推广并广泛应用。

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