非小细胞肺癌组织EGFR/ALK/ROS1基因联合检测的临床意义*

郭 华，齐宗利，张海祥，李真真，房国栋，李文生

(陕西省人民医院a.病理科；b.中心实验室，西安 710068)

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的肿瘤，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是我国肺癌的主要病理类型，占肺癌患者总数的80%～85%，五年生存率仅为10%左右[1]。大部分患者确诊时已为晚期，传统的手术治疗、化学治疗和放射性治疗疗效差，副反应大，总体预后较差[2，3]。研究表明，根据驱动基因突变类型的不同，接受小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)等靶向药物治疗的肺癌患者，其中位生存期明显延长，疗效得到显著改善[3，4]。这些最常见的驱动基因包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)和肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(ROS proto-oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1)等[4，5]。目前，EGFR基因突变的检测已经成为大型医院的常规，但是将EGFR与ALK，ROS1等融合基因在肺癌联合检测的报道并不多。为此，本研究旨在通过对陕西地区NSCLC患者组织标本进行EGFR/ALK/ROS1三种基因的联合检测同时分析其分布情况，为临床靶向治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2017年1月～2018年7月陕西省人民医院病理科确诊为NSCLC患者共146例，其中男性93例，女性53例。男女性别比为1.75∶1，年龄30～93岁，中位年龄为61岁，平均年龄为61.9±11.98岁。肺腺癌122例，肺鳞癌21例，腺鳞癌1例， 类癌2例。

1.2 试剂与仪器 核酸提取试剂盒FFPE DNA，FFPE RNA和FFPE DNA &RNA(厦门艾德生物)；人类EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测试剂盒(ARMS-PCR法，RT-PCR法，厦门艾德)；Nanodrop 2000c核酸测定仪(Thermo Scientific)；ABI 7500荧光PCR仪(ABI公司)。

1.3 检测方法 患者标本均来自于手术切除、细针穿刺活检、支气管镜刷检细胞学和胸腔积液细胞学标本等石蜡包埋组织，且每份标本必须经过病理医师镜下鉴定为合格标本方可检测。核酸提取：切取8～10 μm厚的石蜡包埋组织，常规二甲苯无水乙醇脱蜡水化，柱提法提取组织核酸(DNA或RNA)，Nanodrop检测标本核酸浓度，分别观察A260nm/A280nm和A260nm/A230nm的比值，判断其核酸质量。PCR扩增：将提取的核酸稀释到合适浓度加入反应体系混匀后，按照检测试剂盒说明书程序在ABI 7500扩增仪进行扩增，严格依据试剂盒判定标准确定标本的基因型。对于疑似病例，重新切取蜡卷组织，重新提取核酸，进行重复扩增。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行结果的统计分析，卡方检验比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR/ALK/ROS1基因在NSCLC中的突变频率 对146例NSCLC患者进行基因突变检测后显示，EGFR/ALK/ROS1三个基因联合检测的突变频率为41.8%(61/146)。EGFR，ALK，ROS1三个基因的单突变频率分别为33.6% (49/146)，6.8% (10/146)，2.7% (4/146)。

2.2 EGFR基因各位点突变情况 在51例EGFR基因检测阳性标本中19Ex Del突变率为52.9%(27/51)， 20Ex L858R突变率为41.2% (21/51)；G719X，L861Q突变率为5.9% (3/51)。此外，还检出四例双突变标本：19 Del + L858R(1例)，19Del+ G719X， L861Q (1例)，ALK+19Del(1例)，ROS1+L858R(1例)。

2.3 EGFR/ALK/ROS1基因在不同分组中的突变比例 在146例EGFR/ALK/ROS1三个基因联合检测中，就性别而言，男性突变率为33.3%(31/93)，女性突变率为56.7%(30/53)，二者比较差异有统计学意义(χ2=7.516，P=0.006，P<0.05)；在NSCLC患者病理分类方面，肺腺癌突变率为47.9%(58/121)，肺鳞癌突变率为4.8% (1/21)，二者比较差异有统计学意义(χ2=13.733，P=0.000，P<0.05)。就标本来源而言，手术切除肿瘤组织标本突变率为41.0%(32/78)，细针穿刺活检及支气管镜刷检细胞学突变率为43.4%(23/53)，胸腔积液细胞学标本突变率为40.0%(6/15)，三者比较差异无统计学意义。

3 讨论

EGFR，ALK和ROS1是肺癌较为常见的突变基因。大量研究证明，EGFR的突变状态与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)等的靶向类药物，如吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)和埃克替尼(icotinib)等敏感性密切相关[4，6]；ALK基因的融合与ROS1的重排状态与如克唑替尼和色瑞替尼等靶向药物的使用明显相关[7，8]。美国国立综合癌症网络(NCCN)等权威指南推荐：NSCLC患者在接受克唑替尼治疗之前均应检测ALK基因融合、ROS1基因重排情况，以确定是否适合使用克唑替尼进行治疗[9，10]。因此，及时准确检测NSCLC患者的常见驱动基因的突变状态，对于为患者筛选合适靶向药物具有重要意义。

EGFR基因突变检测的方法很多，包括直接测序法、突变扩增阻滞系统(ARMS)法、片段长度分析和变性高效液相色谱等技术[11]。直接测序法是检测基因突变的金标准，然而该方法的敏感度较低(10%左右)，不适用于临床上活检的小标本组织，难以检测出突变基因，因此，逐渐被ARMS等新的方法取代。ALK基因融合和ROS1基因的重排检测方法主要有三种，包括免疫组织化学技术、荧光原位杂交(FISH)技术和逆转录PCR(RT-PCR)技术等。免疫组织化学技术由于其耗时短、花费低等优点被广泛采用，但其敏感度却较低。荧光原位杂交技术(FISH)以其敏感度和特异度高而被认为是ALK基因融合检测的金标准，但其却因价格昂贵，对实验条件要求高，结果判读存在一定主观性而受到应用限制。RT-PCR技术具有简单、快速、准确的特点，对标本DNA需求量小，尤其适合对临床小标本的检测。本研究就是采用ARMS方法和RT-PCR方法，对同一份标本同时提取DNA和RNA，对EGFR/ALK/ROS1三个基因进行联合测定，取得了较好的效果。

研究发现，EGFR/ALK/ROS1基因总体突变率为41.8%，明显高于单基因检测：EGFR(33.6%)，ALK(6.8%)和ROS1(2.7%)。在EGFR突变中，不同的突变类型其突变频率存在较大差异。19Ex Del和21Ex L858R突变频率最高，分别为52.9%和41.2%。其它类型的突变频率较低，例如，G719X，L861Q突变率为5.9%。同时，研究还证实，EGFR基因突变频率在性别和病理类型上的差异均具有统计学意义，女性EGFR基因突变频率(56.7%)明显高于男性(33.3%)；腺癌的突变频率(47.9%)明显高于鳞癌(4.8%)，这些结果与前期的文献报道基本吻合[12～14]。而且对于NSCLC患者不同来源的标本检测率都较高，特别是无法进行组织活检的晚期患者，视具体情况可选用穿刺标本及胸腔积液这些取样方便、创伤小的标本代替组织检测基因突变状态。此外，近年研究报道的双突变或共突变文献逐年增多[15～17]，这些EGFR出现的共突变多为一个常见突变与一个罕见突变，或者两个罕见突变的共突变，很少见到两个常见突变(如Ex19 Del和L858R)同时出现，研究中检测出了四例双突变标本，其中的具体原因需要进一步研究。

通过对NSCLC患者中三个常见基因EGFR/ALK/ROS1的联合检测结果进行统计分析，联合检测突变率高于任何一个单一基因检测。ALK和ROS1基因的突变率虽然较低，但对穿刺标本和支气管镜等标本同时进行DNA及RNA检测时尤其有必要，可以提供更多的基因突变信息，为临床药物的选择提供更多参考依据。

总之，对NSCLC组织进行EGFR/ALK/ROS1基因联合检测对于患者临床靶向治疗具有重要的现实意义。