多发性骨髓瘤患者外周血单个核细胞中白细胞介素-17的表达及意义

秦卫玲，邢会茹，赵玉洁，武金日，窦敬芳，贺立山

（1.新乡医学院第三附属医院血液内科，河南 新乡 453003；2.新乡医学院第一附属医院血液内科，河南 卫辉453100）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）属于B细胞恶性克隆性疾病，以骨髓瘤细胞克隆性增殖并引起溶骨性骨骼破坏为主要特征，临床表现以广泛性骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高黏滞综合征及肾功能不全等多见。白细胞介素-17（interleu-kin-17，IL-17）是一种新近发现的炎症前细胞因子，在自身免疫性疾病、炎症发生及抑制排斥过程中均起关键性作用。IL-17主要来源于活化的Th17细胞，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、记忆性CD4+T淋巴细胞及自然杀伤T细胞（natural killer T cells，NK-T）也是其重要的来源细胞，其在MM发病及进展中的作用已经成为近年来的研究热点之一［1］。本研究通过探讨MM患者外周血PBMC培养液上清中IL-17的含量及细胞基因表达，进一步佐证其在该病病程中的作用，为MM的临床诊疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择新乡医学院第三附属医院血液科2016年1月至2017年1月确诊的30例MM患者为观察组，患者均符合张之南《血液病诊断及疗效标准》诊断标准［2］，既往无血液系统疾病史，未伴发其他免疫系统疾病。根据Ann Arbor国际分期标准［3］进行疾病分期，其中I期2例，Ⅱ期12例，Ⅲ期16例。30例患者中男17例，女13例，年龄45～65岁，中位年龄55岁。选择与MM患者性别、年龄相匹配的健康献血者30例作为对照组，其中男19例，女11例，年龄43～65岁，中位年龄53岁。2组受试者的性别、年龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理学委员会批准通过，并与患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司，RPMI 1640培养液和胎牛血清均购自上海玉博生物科技有限公司，佛波酯 （phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）和0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）购自美国Sigma公司，人外周血淋巴细胞分离液、TRIzol抽提液均购自美国Invitrogen公司，实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司，酶标仪购自上海闪谱科技有限公司。

1.3 PBMC分离及培养无菌条件下分别采集2组受试者的外周静脉血5 mL，应用密度-梯度离心法分离所有受试者的PBMC，0.4 kg·L-1锥虫蓝染液检测细胞活力合格，应用RPMI 1640完全培养液稀释浓度至5.0×105L-1后接种于6孔细胞培养板内，加入 PMA并使其终浓度为100μg·L-1，置于37℃、含体积分数5%CO2的培养箱内备用，实验时选择处于对数生长期细胞应用。

1.4 PBMC培养液上清液中IL-17水平检测2组受试者的PBMC分别培养至72 h，应用人IL-17 ELISA检测试剂盒检测培养液上清液中IL-17含量，操作方法严格按照试剂盒说明书进行，酶标仪读取260 nm波长下的吸光度值，应用ELISA分析软件绘制标准曲线，并计算IL-17水平。

1.5 PBMC总RNA提取及IL-17 m RNA检测将PBMC培养72 h后，3 000 r·min-1离心15 min收集细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，紫外线分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测RNA合格后备用。按照qRT-PCR试剂盒操作说明检测IL-17 mRNA表达，采用20μL反应体系进行。扩增条件为：95℃预变性40 s，95℃变性 15 s，退火 30 s，60℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃延伸7 min；普通PCR完成后共40个循环，扩增结束后收集数据进行分析，基因的相对表达采用2-△△Ct分析。目的基因及内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物如下：IL-17（231bp）上游引物为 5′-AAGACTGAACACCGACTAAG-3′，下游引物为5′-TCTCCAAAGGAAGCCTGA-3′；GAPDH（541bp）上游引物为 5′-AGCACCCCTGGCCAAGG-3′，下游引物为 5′-CTTTACTCCTTGGAGGCCATG-3′。

1.6 PBMC共培养观察组患者的PBMC培养72 h后（培养方法同前），3 000 r·min-1离心15 min收集培养液上清液，将其与对照组受试者的PBMC共培养。分别于培养24、72 h后离心收集细胞，PBS清洗3次，依次经体积分数2.5%戊二醛4℃固定过夜，梯度乙醇脱水（体积分数分别为25%、50%、75%、100%、100%，每个浓度梯度15 min），醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥后表面喷金，应用扫描电子显微镜观察PBMS的形态。

1.7 统计学处理应用SPSS 19.0统计软件包进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，2组样本均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC培养液上清液中IL-17水平观察组和对照组患者PBMC培养液上清液中IL-17的含量分别为（30.79±4.96）、（10.10±4.15）ng·L-1，观察组患者PBMC培养液上清液中IL-17的含量高于对照组患者，差异有统计学意义（t＝3.412，P＜0.05）。

2.2 PBMC中IL-17 m RNA表达观察组和对照组患者PBMC中IL-17 mRNA的相对表达量分别为4.28±1.34、2.45±0.95，观察组患者 DBMC中 IL-17 mRNA的相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（t＝2.796，P＜0.05）。

2.3 对照组受试者PBMC共培养后细胞形态对照组受试者PBMC形态随着共培养时间的延长而发生改变，共培养24 h时细胞具有伪足或突起，培养72 h时细胞形态发生显著改变，表现为细胞膜粗糙，伪足和突起明显增多，部分细胞甚至出现细胞膜脱落及崩解（图1）。

图1 共培养前后对照组PBMC形态（扫描电子显微镜，×1 000）Fig.1 Shape of PBMC in control group before and after co-culturing（scanning electron m icroscope，×1 000）

3 讨论

MM是血液系统最常见的恶性肿瘤之一［4］，骨髓克隆性浆细胞恶性增生及单克隆性免疫球蛋白增多是其主要临床特征，该病病因及发病机制尚未明确，目前多以放射治疗、化学治疗为主，因此，寻找新的治疗方法具有重要意义。研究证实，MM患者往往存在多重免疫系统功能紊乱，T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞等均在数目和功能上存在不同程度异常［5］。以往多以针对B淋巴细胞为主导的体液免疫异常作为主要靶点，越来越多的研究显示，T淋巴细胞主导的细胞免疫异常在MM的发病中也起着举足轻重的作用［6］。

IL-17是一种促炎症性细胞因子，主要来源于活化的记忆型CD4+T淋巴细胞，通过与受体特异性结合，促进包括白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等多种炎症因子的产生，在促进炎症发展、免疫应答及造血过程中发挥重要的调节作用［7-8］。PRABHALA等［9］研究发现，Th17细胞不但可以诱导骨髓瘤细胞的形成，其分泌的细胞因子IL-17在促进骨髓瘤细胞增殖的同时，还可以抑制自身免疫功能。张耀等［10］研究证实，MM患者外周血Th17细胞的比例及细胞因子IL-17含量均明显高于正常人，推测其可能作为启动因素参与了MM患者的发病过程，并促进了病情的进展。杨云等［11］发现，应用沙利度胺治疗后的MM患者外周血中Th17细胞比例、核转录因子维A酸相关孤儿受体γt（retinoid-related orphan receptor gamma-t，RORγt）mRNA表达水平及血浆IL-17水平均显著低于治疗前，推测抑制Th17细胞可能是沙利度胺发挥抗MM细胞的作用机制之一。

PBMC是一种重要的血液循环细胞，由执行不同功能的细胞亚群构成，其中T淋巴细胞是其主要成员。PBMC表面的Toll样受体2和8等受体激活后可以分泌更高水平的促炎因子，后者与MM的发病密切相关［12］。本研究发现，观察组患者的PBMC培养液上清液中IL-17水平及IL-17mRNA表达与对照组相比均明显升高，将其培养液上清液与正常PBMC共培养一段时间后，后者的细胞形态发生改变，甚至出现破裂，推测MM患者的PBMC培养液上清液中可能存在着促进PBMC进一步活化的活性物质。

综上所述，MM的发病机制目前仍不清楚，PBMC及其分泌的细胞因子IL-17在该病的发生和发展中可能扮演着重要角色，其能否成为该疾病临床治疗的一个潜在靶点，有待进一步研究证实。

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