腺苷预处理对氧糖剥夺复氧糖后星形胶质细胞中血管内皮生长因子和血管生成素-1水平的影响

马世江，尉 娜，韩艳艳，谭 军

（新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003）

脑卒中是临床上常见的脑血管疾病，致残率极高，居人类病死原因的第2位［1］，其中缺血性脑卒中约占全部脑卒中的80%。缺血性脑卒中的治疗目的主要是改善脑血流，减轻脑缺血后的神经损害，提高脑细胞对缺血的耐受。脑血流的恢复不可避免地导致缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）［2］，缺血耐受是机体抵抗 IRI的一种生物现象。目前，通过药物启动和促进内源性保护机制而抑制IRI已成为国内外研究的热点。本研究选择腺苷作为缺血预处理药物，探讨腺苷预处理对脑IRI大鼠星形胶质细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）水平的影响，为临床应用腺苷预防和治疗缺血性脑卒中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物Sprague Dawley大鼠60只，雌雄不限，出生24 h内，体质量10～12 g，由新乡医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉博士德生物有限公司）；腺苷注射液（沈阳光大制药有限公司，国药准字H20030320）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）。CO2恒温细胞培养箱（德国Heraeu公司）；TD2-60B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 实验方法参照文献［3-4］进行星形胶质细胞培养。体积分数75%乙醇消毒大鼠，放入超净工作台内，用眼科剪在乳鼠后颈部做倒“T”型切口，挑起颅骨剪开，暴露双侧大脑半球，依据星形胶质细胞在大脑皮层分布特点选取大鼠大脑皮质，准确剥离脑膜、血管膜，通过机械吹打法和差速贴壁法进行处理，然后进行细胞传代培养。对培养至第3代的星形胶质细胞应用免疫荧光法进行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鉴定。然后将第3代星形胶质细胞传代至96孔板内，培养至细胞贴壁并伸出突触后，随机分为正常对照组、氧糖剥夺组和腺苷预处理组。正常对照组细胞不进行氧糖剥夺，在氧糖剥夺期及复氧糖期均更换高糖DMEM。氧糖剥夺组细胞在氧糖剥夺期更换为无糖、无血清的DMEM；腺苷预处理组细胞在氧糖剥夺前24 h给予含100μmol·L-1腺苷的高糖DMEM培养，氧糖剥夺期将培养基更换为无糖、无血清DMEM。氧糖剥夺期，将氧糖剥夺组和腺苷预处理组细胞放入含体积分数95%氮气、体积分数5%CO2的自制缺氧仓内缺氧8 h；在复氧糖期，氧糖剥夺组及腺苷预处理组细胞培养基更换为预热的含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM，随即转移至37℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内继续培养24 h。正常对照组在37℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中孵育。

1.4 星形胶质细胞形态学观察用德国Leica光学显微镜观察3组星形胶质细胞在复氧糖24 h后的形态变化。

1.5 四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，M TT）法检测各组星形胶质细胞的活力取各组大鼠星形胶质细胞以1×108L-1密度接种于96孔板，每孔加入MTT 50μL，混合均匀，放入细胞培养箱继续孵育4 h，然后1 000 r·min-1离心5min，弃去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），摇晃 10 min，在 37℃条件下，450 nm波长处测细胞吸光度值，每组设5个复孔，重复测定3次，吸光度值越高代表细胞活力越高。

1.6 ELISA法测各组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF和Ang-1水平取各组大鼠星形胶质细胞以密度为5×107L-1接种于24孔板，每组设3个复孔，实验重复3次。应用ELISA试剂盒检测各组细胞培养基上清液中VEGF和Ang-1水平。

1.7 统计学处理应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较均采用Tukey法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠星形胶质细胞形态变化复氧糖24 h后，正常对照组星形胶质细胞生长状态良好，大量的突触在相连的细胞之间形成（图1A）；氧糖剥夺组星形胶质细胞胞体变圆，水肿明显，细胞形态由不规则形变成梭形，突起明显变短甚至消失（图1B）；腺苷预处理组星形胶质细胞水肿较氧糖剥夺组轻，细胞排列相对整齐（图1C）。

图1 各组大鼠星形胶质细胞形态（×400）Fig.1 M orphology of astrocyte in each group（×400）

2.2 各组大鼠星形胶质细胞活力比较正常对照组、氧糖剥夺组和腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞活力分别为 0.698±0.059、0.196±0.062、0.412±0.009。氧糖剥夺组大鼠星形胶质细胞活力低于正常对照组，差异有统计学意义（q＝3.561，P＜0.05）；腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞活力高于氧糖剥夺组，差异有统计学意义（q＝2.102，P＜0.05）。

2.3 各组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF水平比较正常对照组、氧糖剥夺组、腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF水平分别为（0.038±0.005）、（0.053±0.007）、（0.084±0.006）μg·L-1；氧糖剥夺组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义（q＝1.394，P＜0.05）；腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF水平显著高于氧糖剥夺组，差异有统计学意义（q＝1.584，P＜0.05）。

2.4 各组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中Ang-1水平比较正常对照组、氧糖剥夺组、腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中Ang-1水平分别为（0.030±0.007）、（0.049±0.008）、（0.080±0.004）μg·L-1。氧糖剥夺组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中Ang-1水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义（q＝1.633，P＜0.05）；腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中Ang-1水平显著高于氧糖剥夺组，差异有统计学意义（q＝1.632，P＜0.05）。

3 讨论

机体的自我保护作用在脑缺血发生后会产生代偿，缺血区血流改善有利于减轻缺血性脑梗死的损害［5］。在缺血性脑卒中的病理生理过程中，缺血区中心部位的脑细胞在一定时间内会发生不可逆损伤，血流恢复是改善缺血损伤的关键。IRI的提出受到医学界广泛关注，脑缺血后会出现缺氧、自由基和兴奋性氨基酸增多、细胞内钙超载等病理生理变化。研究显示，谷氨酸的兴奋性毒性是脑IRI的重要机制之一［6］。因此，降低谷氨酸水平，也是减轻脑缺血再灌注神经元损伤的重要策略。

腺苷作为一种内源性神经保护剂，可与G蛋白耦联受体相结合，激活三磷腺苷依赖的钾离子通道，阻止兴奋性氨基酸诱导的神经元除极效应，抑制兴奋性氨基酸释放，降低细胞膜对Ca2+的通透性，扩张血管，抑制炎性细胞黏附和浸润，抑制血小板聚集，减轻炎性细胞、自由基导致的血管内皮损伤［7-8］。腺苷在临床中较常用，也是脑缺血疾病相关基础研究的热点，具有效果好、价格便宜等优点［9］。本实验选择腺苷进行缺血预处理，通过对大鼠星形胶质细胞形态学观察及细胞活力检测发现，腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞活力显著高于氧糖剥夺组，表明腺苷预处理可以对细胞发挥保护作用，改善IRI。

星形胶质细胞是中枢神经系统的主要支持成分，具有联系神经元、调节神经元代谢、分泌神经营养因子、组成血-脑屏障及促进神经系统损伤后修复的作用［10］。研究发现，在脑梗死大鼠模型中，梗死灶周围的星形胶质细胞被激活［11］，说明激活的星形胶质细胞在神经元损伤修复过程中起到了关键作用。研究表明，血管再通与神经元的增殖密切相关［12］。脑IRI后，血管再生可以提高损伤神经元的恢复，促进神经修复，改善后遗症。生长因子、神经干细胞、黏附因子等可以促进血管生成，VEGF和Ang-1最具代表性。VEGF和Ang-1是一类促进血管形成和分化的重要调节因子，与血管的生成关系密切［13-15］。研究表明，脑缺血会诱导VEGF和Ang-1的生成，从而改善缺血边缘区域的血供和恢复缺血脑组织的功能［16］。唐清等［17］研究显示，VEGF具有神经保护作用。SUN等［18］对大脑中动脉阻塞模型大鼠脑内注射外源性VEGF，结果显示，VEGF组新生血管密度较正常组高2倍，较缺血对照组高4倍。而且血清中VEGF水平的升高还可以改善缺血性脑血管病患者的认知功能［19］。Ang-1是血管内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶Tie-2的配体，通过Tie-2的磷酸化，抑制内皮细胞凋亡，促进血管内皮细胞出芽、迁移，稳定血管，促进血管生长。VEGF与Ang-1关系密切，VEGF促进早期血管形成，形成原始血管网，Ang-1则在随后的血管重建中发挥作用，促进成熟的血管网形成。Ang-1还能够抵抗VEGF以及炎症引起的血管渗漏，是一种能够抵抗血管渗漏的内源性蛋白质因子，它能促进和互补VEGF促血管新生的功能［20］。庄越等［21］研究发现，Ang-1可能通过减轻脑血管炎性反应和维持血管内皮细胞完整性来减轻脑血管内皮细胞IRI，从而起到保护作用。本研究结果显示，大鼠星形胶质细胞通过氧糖剥夺，可以刺激Ang-1表达增加；通过腺苷预处理可以进一步增加Ang-1表达，抑制IRI。

综上所述，腺苷预处理可以使氧糖剥夺后的星形胶质细胞损伤减轻，细胞活力增加；表明腺苷预处理可能是通过上调VEGF和Ang-1的表达来减轻大脑损伤，从而产生脑保护作用。本研究为缺血性脑卒中的临床治疗提供了新的思路。

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