DRD4基因多态性对注意缺陷多动障碍儿童静息态脑功能磁共振的影响

钱安丹，王美豪，王欣，刘会茹，李建策，杨闯

（1.温州医科大学附属第一医院 放射科，浙江 温州 325015；2.盐城市第一人民医院 放射科，江苏盐城 224000；3.温州医科大学附属第一医院 精神病与精神卫生科，浙江 温州 325015）

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD），又称为多动症，是儿童时期最常见的精神和行为问题之一。目前认为是一种多基因遗传的疾病，与多巴胺传递系统的异常相关。多巴胺传递系统中研究的热点基因多态性位点是多巴胺D4受体（dopamine D4 receptor，DRD4）基因第3号外显子48 bp的重复次数。许多学者通过影像遗传学方法研究DRD4基因多态性对脑功能产生的影响[1-3]。局部一致性（regional homogeneity，ReHo）和基于种子点的功能连接分析方法可分别衡量静息状态下局部脑区的功能[4]和特定脑区的功能联系[5]。目前尚缺乏DRD4基因多态性对ADHD儿童静息态功能磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）的成像分析，基于前人的研究结果，可推测DRD4不同基因型在静息态fMRI成像中也将显示出局部脑区和功能连接的差异。

1 对象和方法

1.1 对象 2012年9月至2014年12月在温州医科大学附属第一医院精神病与精神卫生科门诊就诊的ADHD儿童56例，年龄7～15岁，均为汉族。入选标准：未经过临床ADHD药物治疗，由2位以上临床经验丰富的精神科医师根据《美国精神障碍诊断与统计手册》第4版（DSM-IV）诊断标准确诊ADHD。排除标准：①根据学龄儿童情感障碍和精神分裂症问卷（K-SADS-PL）终生版排除品行障碍、对立违抗性障碍等其他精神病伴发疾病；②服用过哌酸甲酯等中枢神经兴奋剂类药物，有药物滥用史；③曾发生伴有意识丧失的头部损伤，有神经系统疾病史及其他重大躯体疾病史；④中国修订版韦氏智力量表筛查智商小于75。本研究已通过医院伦理委员会审查批准，所有患儿均由其监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因型测定：采集静脉血样5 mL，采用基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。用primer 5.0软件进行引物设计。上游引物：5’-GCGACTACGTGGTCTAC TCG-3’，下游引物：5’-AGGACCCTCATGGCCTTG-3’。PCR所用试剂：KAPA2G Fast Multiplex Mix。通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，根据打印出的彩色测序图谱，读取基因型。所有受检者均按DRD4第3外显子48 bp数目可变重复串联序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多态性进行基因分型。

1.2.2 数据采集：MRI扫描在美国GE 3Tesla MR仪上进行，使用标准8通道头线圈。扫描全程，受检者被要求配合塞海绵耳塞以减少扫描机器噪声，海绵垫固定头部以减少头部运动。受检者被要求放松，保持不动，闭上眼睛，保持清醒，尽量避免思维活动。先扫描大脑的结构相，以排除脑结构性病变。静息态功能图像依赖的血氧水平波动（blood oxygen level dependency，BOLD）信号采用平面回波成像序列采集（TR=2 000 ms，TE=30 ms，翻转角90°，FOV=192 mm×192 mm，矩阵=64×64，层数31层，层厚为4 mm，层间隔0.2 mm，体积数240）。扫描全程由监护者陪同，保证儿童安全。

1.2.3 数据预处理：数据预处理均采用北京师范大学团队基于Matlab7.12.0（R2011a）平台开发的DPARSF软件批量处理。首先，去除扫描开始后前10个时间点图像，对余下的230个时间点的数据继续以下处理：①时间层校正。②头动校正：使用3个平移参数和3个旋转参数对数据进行校正，剔除了7个头动平移大于3.0 mm或旋转移动大于3.0°的数据，剩余49个患者纳入统计分析。③空间标准化：将蒙特利尔神经病学研究所（Montreal Neurological Institute，MNI）标准三维脑模板叠加至所有受检者的脑图像上以消除每个受检者脑空间结构上的差异，重采样体素大小为3 mm×3 mm×3 mm。

1.2.4 局部一致性分析：在数据预处理结束后，继续在DPARSF软件上进行以下步骤： ①去线性漂移：降低由于MRI设备发热以及因受检者的适应存在线性趋势所造成的影响。 ②低频滤波：选择0.01～0.08 Hz的频率范围。③计算全脑每个体素与其相邻数个体素间在时间序列上的相似性，Cluster Size设为27 voxles，体素大小为3 mm×3 mm×3 mm，得到该体素的肯德尔和谐系数（Kendall’scoefficient concordance，KCC）。以每一个体素的KCC值除以全脑全部体素KCC的均值，获得标准化的全脑ReHo图。④空间平滑，使用全宽半高为4 mm×4 mm×4 mm的高斯函数进行空间平滑。

1.2.5 功能连接分析：功能连接分析是在预处理结束后，继续在DPARSF软件上进行以下步骤：①空间平滑。②去线性漂移。③低频滤波。④去除协变量，去除6个在校正中获得的头动参数、全脑信号、白质以及脑脊液信号。⑤定义ROI采用种子相关分析方法，选取的ROI是从ReHo的变化得出的脑激活图中。研究指出角回间接参与认知及注意力的调控，并与ADHD的发病关系密切，因此选取左侧角回为感兴趣区。⑥计算ROI的平均时间序列，并将该平均时间序列与全脑其余体素的时间序列作Pearson相关分析，以其相关系数值作为功能连接的强度。

1.3 统计学处理方法 将DRD4 4R/4R基因型的ADHD患儿与DRD4 2R基因型的ADHD患儿的ReHo图及功能连接图导入Matlab 7.12.0（R2011a）平台的静息态磁共振数据分析工具包进行统计学分析。采用两样本t检验进行2组之间的比较，多重比较校正采用Alphasim算法，P＜0.01为差异有统计学意义。得到cluster size＞486 mm3认为差异有统计学意义，结果在Slice Viewer中显示，并记录这些差异有统计学意义的ReHo值（用“t”表示，t值越大，则相邻体素间的相似程度越高）和相关强度（用“t”表示，t值越大，则脑区间连接的相关性越强）。计量资料采用两样本t检验，计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 所有纳入的受检者根据DRD4重复等位基因的次数分为携带DRD4 4次重复等位（4R/4R）基因型的ADHD儿童（DRD4 4R/4R组）与携带DRD4 2次重复等位（2R）基因型的ADHD儿童（DRD4 2R组）。其中DRD4 4R/4R组30例；DRD4 2R组19例，其中2R/4R基因型16例，2R/2R基因型1例，2R/5R基因型1例，2R/3R基因型1例。本组患儿中DRD4 48 bp VNTR多态性以4R（占46.9%）为主，其次是2R（占20.4%）。2组患儿符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则。2组患儿性别及ADHD亚型比例差异无统计学意义（χ2=0.024、1.097，P＞0.05），年龄和智商差异无统计学意义（t=1.846、0.173，P＞0.05）。临床量表的行为评估包括Conners父母用量表、Stroop效应色词测试和威斯康星卡片分类测试，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 ReHo结果 DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组ADHD儿童在静息状态下ReHo变化的脑区（Alphasim校正，P＜0.01）。ReHo值升高的脑区主要有：两侧小脑后叶、舌回，右侧枕叶、枕颞内侧回、枕颞外侧回；ReHo值降低的脑区主要有：左侧缘上回、角回、中央前回，见表2和图1。

2.3 功能连接结果 在静息状态下DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组ADHD儿童以左侧角回为种子点得到的功能连接变化的脑区，功能连接增强的脑区主要有：两侧小脑前叶、中脑，右侧额下回、颞中回、颞上回、楔前叶；功能连接减弱的脑区主要有：两侧枕叶，左侧额上回、额内侧回、直回、顶上小叶，右侧楔叶，见表3和图2。

表1 DRD4 4R/4R组和DRD4 2R组ADHD儿童的临床资料比较（ ±s）

表2 DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组ADHD儿童ReHo值变化的脑区

图1 DRD4 4R/4R组和DRD4 2R组ADHD儿童ReHo值变化的脑激活图谱

3 讨论

多巴胺系统的紊乱被认为是很多精神疾病的病理机制，也是ADHD的发病机制之一。DRD4是一种DRD4基因编码的G蛋白耦联受体，DRD4基因的重复等位基因变异次数可从2次到11次，最常见的是4次、7次和2次，平均所占比例分别约为67%、12%和10%。在本研究的基因型分析中，因样本中7R等位基因的缺失，将其分为DRD4 4R/4R等位基因组和2R等位基因组，可独立探究2R基因型对脑功能的影响。对于DRD4在人脑中的分布仍存在争议[6]。一项采用RTPCR技术检测人脑组织的研究得出DRD4在额叶脑区、扣带回以及颞叶、海马、杏仁核、枕叶和小脑等脑区表达较高，而在黑质、纹状体和顶叶等脑区的表达程度则相对较低[7]，本研究也显示DRD4高表达区在静息状态下有显著的局部一致性的改变和功能连接的异常。DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组相比，ReHo值升高以右侧为主，颞枕叶及小脑显著，ReHo值降低主要集中在左侧角回脑区附近；功能连接增强以右侧额叶-小脑环路为著，降低以两侧枕叶区及左侧额叶脑区显著。

本研究中DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组相比，ReHo值升高包括右侧颞枕叶、两侧舌回及两侧小脑。相关fMRI研究发现，在7～13岁的儿童大脑发育过程中，舌回区域的BOLD信号强度和范围与这些区域的神经元髓鞘形成密切相关[8]。此后庞高峰等[9]利用静息态fMRI对学龄期儿童的研究显示，随着年龄增长，舌回区域的神经元髓鞘逐渐形成，从而引起该脑区ReHo值增高，同时与之相关的认知功能也逐渐增强。可以推测DRD4 2R基因型患儿可能相对于4R/4R基因型患儿神经元髓鞘发育延迟，与ADHD神经发育延迟的病因假说[10]一致。

本研究结果显示ReHo值降低主要集中在左侧角回脑区附近。已有影像学研究证实角回与ADHD关系密切[11]。有研究指出角回间接参与认知及注意力的调控，角回作为多模式整合中心，在完成诸如阅读、理解、空间认知和注意力等任务时被激活[12]。角回也是额-顶叶网络的一部分，负责整合内部和外部信息以做出应答。ADHD任务态fMRI的研究中，已发现涉及抑制运动的任务会导致此网络内的活动度减低[11]。本研究显示DRD4 4R/4R基因型的左侧角回ReHo较DRD4 2R基因型明显降低，表明DRD4基因多态性可能参与调节角回的活动。

本研究发现DRD4基因不仅可以调节局部的脑区活动，同时对脑区之间的连接也有显著的作用。DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组相比，两侧小脑的Reho值升高，与左侧角回之间功能连接增强的脑区也包括了右侧额叶-小脑环路。传统观念认为小脑参与调节躯体平衡和肌肉张力，以及协调随意运动，但已有研究证实小脑与高级皮层有广泛连接，该通路被认为与认知功能和执行控制功能相关。GILSBACH等[2]也发现非DRD4 7R等位基因携带者（以4R基因型为主）在执行控制任务中可表现出小脑与前扣带回、额下回脑区间呈血流动力学反应的强连接。有学者认为ADHD患者伴有执行功能缺陷[5]，且不同DRD4基因型在多动冲动症状有显著差异[1]，但本研究中2组间执行功能任务与多动冲动症状指标的差异无统计学意义（见表1），可能与样本量较少有关。

表3 DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组ADHD儿童以左侧角回为种子点得到的功能连接变化的脑区

图2 静息状态下DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组 ADHD儿童以左侧角回为种子点得到的功能连接图谱

DRD4 4R/4R组与DRD4 2R组相比，与左侧角回之间功能连接降低以两侧枕叶区及左侧额叶脑区显著。任务态fMRI研究中发现DRD4基因可调控平均BOLD信号的改变，在右侧额下回、枕叶和小脑区域有显著的血流动力学反应[13]，与本研究结果一致。目前有效的ADHD治疗药物哌酸甲酯可改善临床症状，可显著地减少ADHD患儿视皮层区域的局部脑血流量[14-16]。视皮层区域的活动增强也被认为与ADHD患者的注意力缺失相关[14]。这些结果提示DRD4 2R组较DRD4 4R/4R组患儿的注意力缺陷症状可能更显著，虽目前没有可靠的临床指标支持，但可为DRD4基因对ADHD患儿枕叶脑区的调控作用提供影像基础。

本研究中DRD4 4R/4R组的左侧额上回、额内侧回、直回较DRD4 2R组的功能连接明显下降，与DURSTON等[17]的研究结果相似。动物实验表明DRD4多态性可调控前额叶皮层同步网络活动[18]，这一结果也在正常青少年fMRI研究中得到证实[2]。此外，“冷”执行功能主要受前额叶脑区调控，与注意缺陷症状有关，DRD4基因可调控前额叶等控制功能脑区的多巴胺功能[13]。故有研究提出DRD4 2R基因型对执行控制功能产生影响[19]。本研究进一步验证DRD4基因多态性与左侧额叶活动的相关性，而右侧额叶-小脑环路连接增强可能是对左侧额叶脑区功能连接降低的一种补偿。

研究发现ADHD患者在纹状体区有显著的脑功能改变，而且额叶-纹状体通路的异常在ADHD的发病机制中有相当重要的地位[20]，然而本研究结果却未发现这种显著差异性。可能是由于我们选取的DRD4在纹状体区表达水平较低，但仍显示额叶-小脑环路的异常连接，与之前的研究[5，21-23]相符。以患有ADHD的男孩与未患病的兄弟姐妹为样本的研究提示小脑可能与ADHD的遗传风险相关[24]。小脑与大脑一样有着复杂的神经联系，小脑的高级认知作用也是不可忽视的，其结构和功能上的改变在ADHD发病机制中起关键作用。

本研究联合ReHo与功能连接两种分析方法，从局部脑区活动和特定脑区间连接出发，更全面地分析ADHD在DRD4基因影响下的病理生理基础。研究对象基于未服用过哌酸甲酯治疗的ADHD患儿，均为汉族，有利于减少混杂因素的影响[21]。由于该人群样本的独特性，同时研究了DRD4 2R基因型对ADHD患儿的影响。但本研究仍有一些局限性，首先，本研究中未发现DRD4不同基因型之间的临床量表差异，包括执行控制功能和多动冲动症状，仍需扩大样本量以寻找ADHD的临床指标与影像遗传学上的关联；其次，ADHD患儿的亚型也可能会对研究结果产生混杂效应[25]，这一点未进行事先的分组讨论，将来的研究可以着重研究不同ADHD亚型之间的fMRI区别；最后，横断面设计限制了研究结果的有效性，但是，可行性的研究成果为未来的纵向研究提供了研究基础。

综上所述，DRD4基因多态性对ADHD患儿的局部功能区和特定功能脑区的连接产生了显著的影响，主要包括额叶-小脑环路的异常改变，涉及抑制控制及执行控制功能的脑区，进一步提示小脑与ADHD的相关性，为解释ADHD患儿的神经机制提供了影像病理基础。