过表达SIAH1通过上调Hrk表达诱导乳腺癌细胞凋亡

钱立勇，杨志强，温媛媛

（舟山医院，浙江 舟山 316021，1.病理诊断中心；2.呼吸内科）

SIAH1（seven in absentia homolog 1）是近年来发现的凋亡相关蛋白。SIAH1是果蝇属SINA（Drosophila seven in absentia）蛋白的同系物[1-2]。YOSHIBAYASHI等[3]发现，过表达SIAH1可调节肝癌细胞的凋亡。另有研究发现，在乳腺癌细胞中SIAH1可显著激活由辐射诱发的凋亡[4]。Hrk（Harikari）与Bim（Bcl-2-interacting mediator of cell death）同属于BH3亚家族成员。Hrk最初由INOHARA等[5]在Hela细胞中发现Hrk mRNA在人类淋巴组织、胰腺、骨髓和脾脏中高表达，在肾脏、肝脏、肺和脑组织中不表达。我们最近发现在乳腺癌细胞系中，过表达SIAH1可以通过激活MAPK/JNK通路来上调Bim的表达，进而诱导乳腺癌细胞凋亡[6-7]。Hrk与Bim同属于BH3亚家族成员，Hrk在SIAH1调控细胞凋亡中的作用尚未明确。本研究应用免疫组织化学SP法检测乳腺组织中SIAH1与Hrk蛋白的表达，并分析二者与乳腺癌临床病理参数的关系。应用Western blot法与RT-PCR法检测SIAH1与Hrk在乳腺细胞系中的表达情况。通过转染SIAH1表达质粒和Hrk siRNA，分析SIAH1与Hrk的表达及乳腺癌细胞的凋亡情况。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2000年1月至2014年12月舟山医院病理科女性乳腺手术切除标本，包括86例乳腺浸润性导管癌及其对应的32例癌旁正常组织。所有患者术前均未接受放、化疗。标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，HE常规染色后明确诊断。本研究经本院伦理委员会批准，并获得患者的知情同意。

86例乳腺浸润性导管癌标本中，肿瘤直径＜3 cm者48例，≥3 cm者38例；根据2010年乳腺癌TNM分期标准进行分类[8-9]，临床分期显示I+II期47例，III+IV期39例；根据2012年WHO推荐的乳腺癌组织学分类标准[10]，病理分级I+II级44例，III级42例；淋巴结转移37例，无淋巴结转移49例。

1.2 主要试剂 免疫组织化学检测试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司，SIAH1抗体、Hrk抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1和对照质粒pcDNA3-myc由Matsuzawa Shu-ichi教授（美国加利福尼亚拉霍亚伯纳姆研究所）惠赠，Hrk siRNA检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司，Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国Cell Signaling公司，DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒购自大连Takara公司，PCR引物合成与测序委托大连Takara公司完成。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色及结果判定：组织标本经4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成4 μm切片。采用SP法，按试剂盒说明书步骤进行抗SIAH1（1∶400）、Hrk（1∶400）抗体免疫组织化学染色，PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。结果判定：SIAH1和Hrk以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。每张切片在光镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，按SIAH1和Hrk表达百分率分为4个等级：0%为0分，1%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分。根据染色强度分为4个等级：0分为无阳性细胞，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为黄褐色。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分＜4为阴性，积分≥4为阳性。

1.3.2 细胞培养、细胞转染及RNA干扰：共培养2种乳腺细胞系，包括乳腺癌细胞系MCF-7及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，细胞均为贴壁生长的细胞系。细胞接种在含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，在37 ℃、5%CO2环境下培养。

使用脂质体Lipofectamine2000将各质粒或干扰片段转染入MCF-7细胞中，具体步骤：将MCF-7细胞的培养基更换为无胎牛血清无抗生素培养基（双无培养基），饥饿细胞3 h以便提高转染效率。将24 μg SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1、24 μg对照质粒pcDNA3-myc、10 μg Hrk siRNA干扰片段、10 μg control siRNA分别与1.5 mL双无培养基室温下混匀，分别为pcDNA3-SIAH1组、pcDNA3组、Hrk siRNA组、control siRNA组，未处理组使用正常培养基培养，即含胎牛血清与抗生素的培养基，取60 μL脂质体Lipofectamine2000与1.5 mL双无培养基混匀，室温孵育5 min，将稀释后的质粒或干扰片段与Lipofectamine2000混匀，室温孵育20 min，将上述混匀的混合液加入待转染细胞MCF-7中，6 h后换正常培养基，培养至转染48 h后收集细胞，进行下一步检测。共转染pcDNA3-myc-SIAH1+Hrk siRNA方法，即pcDNA3-SIAH1+Hrk siRNA组为按上述步骤转染pcDNA3-myc-SIAH1 36 h后，将10 μg Hrk siRNA/双无培养基的混合液与脂质体Lipofectamine2000/双无培养基的混合液混匀后加入，6 h后换正常培养基继续培养细胞24 h，收集细胞进行检测。

1.3.3 Western blot：收集细胞经预冷的PBS清洗3次，加入500 μL细胞裂解液和蛋白酶抑制剂复合物冰浴下超声处理，4 ℃静置24 h，4 ℃、13 000 r/min离心30 min，提取总蛋白。加样，上样蛋白量为60 μg。经聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳1.5 h后，转印至PVDF膜，室温下5%正常小牛血清封闭2 h，将膜放在含一抗的封闭液中，一抗分别为山羊抗人SIAH1（1∶400），山羊抗人Hrk（1∶400）和抗β-actin（1∶200），4 ℃孵育过夜。TTBS洗膜3次，每次10 min，然后加入二抗中（1∶2 000），室温孵育2 h，ECL发光。凝胶成像系统采集图像，将目的蛋白与β-actin光密度值作为相对表达量，实验至少重复3次，取平均值。

1.3.4 RT-PCR：使用Trizol试剂提取细胞总RNA后，反转录使用OligoDT引物，合成cDNA条件为：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃5 min。反转录获得cDNA，以反转录的cDNA为模板，扩增mRNA，进行PCR反应。PCR引物经GeneBank上Blast比对后合成，以β-actin为内参。PCR引物为SIAH1：上游：5’-TCCAACAATGACTTGGCGAGT-3’，下游：5’-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG-3’；Hrk：上游：5’-CGATCC ACACGGAGTACTTG-3’，下游：5’-GGATGCAGAAGGAGATCA CTG-3’；β-actin：上游：5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。扩增体系为30个循环，取扩增产物5 μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，成像分析，测定扩增带灰度值，得到mRNA的相对表达量。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡：取对数生长期的细胞，以1×104/mL的密度接种于细胞培养瓶内，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。收集细胞，加入300 μL的1×binding buffer悬浮细胞，再加入5 μL的An-nexin V-FITC混匀后进行Annexin V-FITC标记，最后加入5 μL的PI染色，经处理过的细胞在流式细胞仪上进行分析。结果分析中左上象限代表坏死细胞，左下象限代表正常细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞和死亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以 ±s表示，两样本比较采用独立样本t检验，多组样本比较采用随机区组设计的方差分析。计数资料采用χ2检验，并计算Spearman等级相关系数。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIAH1与Hrk蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及与临床病理特征的相关性 SIAH1与Hrk蛋白阳性表达主要定位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，见图1。SIAH1与Hrk在乳腺浸润性导管癌中，阳性率分别为32.5%（28/86）、37.2%（32/86）。在相对应的癌旁组织中阳性率分别为84.4%（27/32）、87.5%（28/32），2组比较差异有统计学意义（χ2=7.348、7.125，P＜0.01）。在浸润性导管癌中，SIAH1与Hrk表达均为阳性的标本共23例，表达均阴性的标本49例。Spearman相关性分析显示，SIAH1与Hrk表达呈正相关（r=0.515，P＜0.01），见表1。不同病理分级、临床分期乳腺浸润性导管癌SIAH1与Hrk蛋白表达阳性率比较显示，SIAH1和Hrk蛋白阳性表达与乳腺癌的高病理分级（χ2=8.403、8.514，P＜0.01）、低临床分期（χ2=6.731、6.729，P＜0.05）显著相关。SIAH1和Hrk的表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结是否转移无关（P＞0.05）。见表2。

图1 SIAH1与Hrk在乳腺组织中的表达情况（SP法，×200）

表1 SIAH1与Hrk在乳腺浸润性导管癌中的相关性分析（n=86）

表2 SIAH1与Hrk在乳腺浸润性导管癌中的表达与临床参数的相关性分析[ n=86，n（%）]

2.2 SIAH1与Hrk在乳腺细胞系中的表达 SIAH1与Hrk在乳腺正常上皮细胞系MCF-10A中蛋白（t=4.459、5.102，P＜0.05）与mRNA（t=6.127、5.483，P＜0.05）表达量明显高于在乳腺癌细胞系MCF-7中的表达量，差异有统计学意义，见图2。

2.3 乳腺癌细胞系MCF-7中过表达SIAH1可上调Hrk的表达 在乳腺癌细胞系MCF-7中，使用SIAH1过表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1与对照质粒pcDNA3-myc后，结果表明，瞬时转染48 h后，与转染对照质粒pcDNA3-myc和未处理组相比，转染pcDNA3-myc-SIAH1后SIAH1（F=1.467、2.119，P＜0.05）与Hrk（F=8.965、4.379，P＜0.05）的mRNA和蛋白表达量均显著增加，差异有统计学意义，见图3。

2.4 过表达SIAH1可通过上调Hrk的表达来诱导乳腺癌细胞凋亡 采用Western blot和RT-PCR验证Hrk siRNA的干扰效果，结果表明，瞬时转染Hrk siRNA 48 h后，与未处理组和control siRNA组相比，转染Hrk siRNA后，MCF-7细胞中Hrk蛋白和mRNA表达量均明显减少（F=5.384、6.215，P＜0.05），证明Hrk siRNA是有效的。见图4。为了检测SIAH1与Hrk对乳腺癌细胞凋亡的影响，运用Annexin VFITC/PI试剂盒及流式细胞仪技术检测细胞凋亡。流式细胞仪结果表明，MCF-7细胞转染pcDNA3-myc-SIAH1后细胞凋亡率（29.02%±3.31%）明显高于未处理组（2.69%±0.35%）、pcDNA3组（3.09%±0.52%），差异均有统计学意义（F=180.517、179.314，P＜0.05）。MCF-7细胞共转染pcDNA3-myc-SIAH1和Hrk siRNA（4.40%±0.61%）后，细胞凋亡率明显低于MCF-7细胞单独转染pcDNA3-myc-SIAH1组（29.02%±3.31%），差异有统计学意义（F=187.369，P＜0.05），而与control siRNA组（3.47%±0.11%）、Hrk siRNA组（1.10%±0.50%）比，细胞凋亡率差异无统计学意义（F=20.461、24.537，P＞0.05）。结果表明，过表达SIAH1可通过上调Hrk表达来调控乳腺癌细胞凋亡。见图5。

3 讨论

图2 SIAH1与Hrk在MCF-10A和MCF-7细胞中的表达

图3 转染SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1后SIAH1与Hrk的表达

SIAH1是重要的蛋白泛素化和蛋白水解酶，在调控蛋白降解中发挥重要作用。SIAH1在肿瘤中更是一种重要的肿瘤抑制因子。有研究报道，SIAH1在肝癌中表达缺失或表达下调，SIAH1可抑制肝癌的发生[11]。上调SIAH1表达可通过p38 MAPK激活p53通路来诱导神经脊细胞凋亡[12]。BRUZZONIGIOVANELLI等[13]报道，在乳腺癌细胞系中稳定转染SIAH1表达质粒后，可通过改变有丝分裂和诱导p21Waf-1/Cip-1的表达来抑制细胞的生长。另有研究发现[14]SIAH1可通过作用于p53与p21来促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤形成。

图4 干扰Hrk表达可下调Hrk mRNA与蛋白表达

Bcl-2家族是目前比较公认的凋亡相关蛋白家族，在调控细胞凋亡中发挥重要作用，其包括3个亚家族，分别是：Bcl-2亚家族、Bax亚家族及BH3亚家族（又称BH3-only蛋白）。其中，BH3亚家族成员包括Bik、Blk、Bid、Bad、Bim、Hrk、Puma等。已有研究表明，BH3亚家族成员均可促进细胞的凋亡，起到肿瘤抑制因子的作用[15]。现已明确，Bim在某些促凋亡因子的刺激下被激活，活化的Bim分子可通过与Bcl-2/Bax结合从而激活Bax，最终通过线粒体途径引发细胞凋亡[16]。我们以往研究发现SIAH1和Bim蛋白在乳腺正常组织、不典型增生组织、导管原位癌和浸润性导管癌中表达逐渐降低，且与乳腺浸润性导管癌的高分化和低临床分期呈正相关，且SIAH1与Bim表达也呈正相关[7]。有研究报道Hrk基因是MAPK/JNK/c-jun作用的靶基因[17]。激活MAPK/JNK后可以上调Hrk表达来促进胰腺β-细胞凋亡[18]。Bim与Hrk同属BH3-only亚家族蛋白，均发挥凋亡调节作用，在乳腺癌中SIAH1是否也与Hrk蛋白表达相关，是否也可通过上调Hrk蛋白表达来促进乳腺癌细胞凋亡并不明确。本研究发现，在乳腺浸润性导管癌组织中，SIAH1与Hrk蛋白表达呈正相关，且均与乳腺癌的高病理分级和低临床分期呈正相关。SIAH1与Hrk在乳腺癌组织中表达低于配对的癌旁组织。SIAH1与Hrk在乳腺正常上皮细胞系MCF-10A中表达高于乳腺癌细胞系MCF-7。为了明确SIAH1与Hrk的相互关系，我们瞬时转染了SIAH1表达质粒，鉴于瞬时转染的不稳定性，我们分别在细胞转染24 h、48 h及60 h后收集细胞，无论是转染SIAH1表达质粒还是干扰片段，发现在瞬时转染48 h后转染效率最高，所以后续实验均采用转染后48 h收集细胞。与未处理组及对照质粒组相比较，过表达SIAH1可上调Hrk的表达。为了进一步明确Hrk是否也在SIAH1调控的乳腺癌细胞凋亡中发挥作用，我们共转染了SIAH1表达质粒和Hrk siRNA，结果表明与单独转染SIAH1表达质粒相比，共转染后乳腺癌细胞凋亡率显著下调。这些结果提示Hrk同样也参与了SIAH1诱导的乳腺癌细胞凋亡。

综上所述，SIAH1与Hrk在乳腺癌中表达低于正常乳腺组织，其表达与乳腺癌高病理分级和低临床分期呈正相关。SIAH1可通过调控Hrk表达来促进乳腺癌细胞凋亡，SIAH1与Hrk在抑制乳腺癌形成中发挥重要作用。