miR-429在膀胱癌中的表达及作用机制

吴 斌，房杰群，温似春

1深圳市光明新区人民医院泌尿外科，广东 深圳 518106；2深圳市人民医院泌尿外科，广东 深圳 518020；3广东省人民医院协和病区，广东 广州 510080

膀胱癌为泌尿系统最常见的恶性肿瘤[1]。据统计，2013年美国约有72 500例新诊断的膀胱癌和17 960例膀胱癌死亡病例[2]。膀胱癌有很多病理类型，尿路上皮癌占膀胱癌的90%左右[3]。膀胱癌细胞的复杂表型由功能性反应基因控制。MicroRNA主要是抑制基因表达的小型非编码RNA，它们在癌症中增加或减少，能够促进或抑制癌症发展[4]。有文献报道，miR-429在癌症中表达增加，如子宫内膜癌和结肠直肠癌[5-6]。但有研究表明，miR-429在骨肉瘤，肾细胞癌和宫颈癌中起着抑制肿瘤作用[7-8]。国内研究发现miR-429在膀胱癌中的表达是增加的[9]。miR-429属于miR-200家族，也有文献报道miR200家族在膀胱癌中的表达上调，高microRNA-200C表达与膀胱肌肉浸润性尿路上皮癌中疾病死亡的风险之间应该存在正相关关系[10]。本文为探究miR-429在膀胱癌中的表达及作用机制做了如下研究：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择广东省内3家医院2014年1月～2016年12月期间收集的膀胱癌标本120例，同时选取距离肿瘤边缘大于2 cm的癌旁组织作为对照。所有患者已经病理科明确诊断。具体情况见表1。排除标准：严重电解质紊乱者；严重肝肾功能不全、心功能不全、严重感染者；神志不清，无法配合着。所有受试者已获得知情同意，并已通过我院伦理会的批准。

表1 膀胱癌一般情况分布表（n=120）

1.2 研究方法

1.2.1 组织标本的收集 收集手术过程中经病理确诊的膀胱癌组织，和距离肿瘤边缘大于2 cm（镜下未见癌细胞）的癌旁组织，大小0.5 cm×0.5 cm，将组织置于装入冻存管，置于液氮罐中保存。

1.2.2 RNA的提取和miR-429的QRT-PCR测定 采用Trizol（Invitrogen，Life Technologies）法从组织内提取总RNA，然后反转录成cDNA（PrimeScript RT Reagent Kit，Takara）。用 QRT-PCR法（SYBR Premix Ex Taq Kit，Takara ，7500 real-time PCR system ，Applied Biosystems）测定血清miR-429的表达，用用U6 miRNA作为内参。

miR-429 扩 增 引 物 ：F ：5 ′-GGAATGCGCGA GGAGAACAA-3 ′，R:5 ′-CATCATCATGACCTG GATCGC-3，U6 miRNA扩增引物：F：5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3 ′，R: 5 ′-GGAACGCT TCACGAATTTG-3′。使用公式2–ΔΔCt计算miR-21相对表达量。

1.2.3 细胞培养 用含有10%的胎牛血清，1%链霉素-青霉素双抗的DMEM培养T24细胞系（膀胱癌细胞系）。根据细胞生长情况每1～3 d更换1次培养基。

1.2.4 RNA干扰实验 严格按照说明书（广州瑞博siRNA使用说明（2009-08））进行操作。设置miR-429过表达模型（miR-429 mimic），空白对照（miR-429 mimic control）；miR-429敲除模型（siRNA），空白对照（siRNA control）。分别观察miR-429过表达或者敲除时T24细胞增殖和凋亡情况。

1.2.5 细胞增殖和细胞凋亡实验 采用MTT比色法判断细胞增殖情况；采用Caspase 3 ELISA试剂盒（R&D，Minneapolis，MN，USA）判断细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19. 0 软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差表示，计量资料比较用独立样本的t检验，计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 miR-429的相对表达量

膀胱癌组织miR-429的相对表达水平高于正常膀胱组织，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 miR-429在膀胱癌组织组织和癌旁组织的表达

2.2 miR-429的表达水平与膀胱癌临床相关参数的关系

由表2可知，miR-429的表达水平与膀胱癌的肿瘤大小、有无淋巴结转移，以及TNM分期有关（P＜0.05）；肿瘤直径大于5 cm组miR-429的表达水平高于肿瘤直径小于5 cm组；有淋巴结转移的膀胱癌组miR-429的表达水平高于无淋巴结转移的膀胱癌组；Ⅲ+Ⅳ期膀胱癌组miR-429的表达水平高于Ⅰ+Ⅱ期膀胱癌，差异具有统计学意义（P＜0.05）。miR-429的表达水平与膀胱癌患者的年龄、性别无关（P＞0.05）。

2.3 miR-429过表达或者敲除时T24细胞增殖和凋亡情况

miR-429过表达时，膀胱癌细胞（T24细胞系）增殖增加，凋亡减少；而miR-429敲除时，膀胱癌细胞（T24细胞系）增殖减少，凋亡增加（图2）。

表2 miR-429的表达水平与膀胱癌临床相关参数的关系

3 讨论

统计显示全球有270万人患有膀胱癌[11]。 在发展中国家，人口老龄化和烟草使用量高使得膀胱癌的发病率显著高于发达国家[12]。大约25%的新诊断的膀胱癌患者存在肌肉侵袭，需要根治性手术或放射治疗[13]。肿瘤的发生是一个复杂生物学过程，涉及到多种细胞因子、蛋白、生长分化因子的参与。近年来，关于miRNA与肿瘤发生发展的关系逐渐成为研究热点，研究发现，miRNA与多种肿瘤的发生发展相关[14]。miRNAs参与人类30%～60%基因的转录后调节[15]。由于1个miRNA可作用于上百个不同的基因，因此miRNA的功能失调，可导致正常细胞向癌细胞转化。国外文献报道，超过一半的miRNAs基因位于肿瘤相关基因组区或脆性位点[16]。提示miRNAs在人类肿瘤的发生发展中起重要作用。

图2 miR-429过表达或者敲除时T24细胞增殖和凋亡情况

本研究发现，膀胱癌组织miR-429的相对表达水平高于正常膀胱组织（P＜0.05），这与Yang等[17]研究结果相一致，提示miR-429可能在膀胱癌的发生发展中起着重要作用。进一步相关分析显示，miR-429的表达水平与膀胱癌的肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05）。有研究对165例神经胶质细胞患者进行追踪随访，也发现miR-429高表达的患者，其肿瘤较早发生转移[18]，这也与本研究结果相类似。但也有研究认为miR-429可以抑制星细胞瘤的增殖，可能miR-429在不同类型的肿瘤中具有不同的作用机制[19]。实验结果也发现miR-429可以促进膀胱癌细胞增殖，抑制凋亡。miR-429在膀胱癌中的可能作用机制：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B（CDKN2B）是一种肿瘤抑制因子，CDKN2B 3′UTR具有miR-429的结合位点，miR-429可以与CDKN2B结合[20]。miR-429表达增加，可以抑制CDKN2B的表达，从而促进促进膀胱癌细胞增殖，抑制凋亡。miR-429还可以调控PTEN、RASSF8和TIMP2等抑癌基因以促进肿瘤发生[21]。

综上所述，miR-429在膀胱癌的发生发展中起着重要作用，其表达水平对膀胱癌的严重程度及预后情况具有一定的参考价值。

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