肿瘤血管生成拟态形成的机制

欧洁，王顺超，吴红艳*

（三峡大学医学院1免疫系，2感染与炎症损伤研究所，宜昌443002）

血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）是肿瘤组织供血的重要方式，在侵袭性肿瘤中普遍增加，并与肿瘤发展程度和患者生存预后差相关[1,2]。肿瘤诱导VM形成给当今抗肿瘤治疗带来较多困难，因此，研究肿瘤VM形成机制也是肿瘤防治研究的重要领域。在此，本文简要总结近三年肿瘤促使VM形成机制的相关研究进展。

1 VM的基本特征

VM外观为一种相互连接的网络样结构，分为实质性结构和管腔样结构[3,4]；管腔结构富含基质，内腔为单层癌细胞和分泌性糖蛋白覆盖（例如蛋白聚糖和糖蛋白样层粘连蛋白等）；实质性结构主要为基质包裹的癌细胞。因其不含内皮细胞，VM主要通过高碘酸-希夫（periodic acid-schiff，PAS）染色[5]阳性来鉴定。VM主要在肿瘤缺氧、营养缺乏、肿瘤形成初期和侵袭的过程中，由肿瘤细胞受异常信号调节极化形成，当然目前的研究也证明肿瘤相关免疫细胞（如巨噬细胞）等[3,4,6-8]也参与VM的组成；由于能够形成VM的肿瘤细胞共同表达内皮细胞和干细胞以及肿瘤标志物，并且成血管相关细胞参与VM原始结构的形成[6,9-10]，VM可能为血管内皮细胞形成血管的前体形式。此外，VM具有类似于血管的血液灌注能力，该能力于2017年由Racordon[4]等成功建立的无内皮细胞方式体外替代性灌注途径[4]明确证实。但是基于PAS阳性也存在于无灌注能力的实质结构，研究者使用PAS典型标志物作为检测VM的存在而断定其功能是存在争议的。但是，它们是否能在异常刺激下转化为管腔样的结构还有待确认。

2 肿瘤中VM形成的相关机制

2.1 肿瘤细胞特异性

VM的形成可能因不同机制的调节而存在细胞特异性，比如营养缺乏和生长因子缺乏可诱导三阴性乳腺癌中以间充质细胞系为主的MDAMB-231细胞系、BT-549细胞系、Hs578T细胞系和SUM159PT细胞系形成VM，并且表现出MDAMB-231细胞系和BT-549细胞系中CD44hi/CD24low表型的细胞比例增加，因此推测存在与VM相关的干细胞样群体；而相对的三阴性乳腺癌的其他细胞系却不能被诱导形成VM，表现出VM相关信号受体表达较低[8]。此外，Min Su[11]的实验证明体外低浓度人体绒（毛）膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）能促使OVCAR-3细胞系形成VM并稳定表达HCG受体，而SKOV-3细胞系即使在高浓度的HCG刺激下也不能形成VM。但是，在Racordon[4]体外构建的VM模型中，无明显刺激的情况下SKOV-3细胞系却可以形成VM，而OVCAR-3细胞系却不具备这种能力；再者，他们首次证明肿瘤转移的细胞团块可以通过肿瘤原代培养物的辅助获得形成VM的能力（比如肿瘤引起的腹水），由此推测形成VM的能力不是某一种细胞系所特有，或者通过细胞系衍生来解释等。实质上这种现象目前还处于比较片面的理解状态，大多只是描述某种机制下某种细胞具有形成VM的能力，还缺乏全面的研究证明某种细胞在不同的条件之间如何转换通路而获得形成VM的能力。

2.2 促使VM形成的信号调节机制

2.2.1 MMPs

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）与肿瘤进展程度普遍存在正相关性，作为VM中出现的典型分子，其参与多种机制促进VM的形成。比如恶性胶质瘤中，MMP-2切割Ln-5成105kD的Ln-5c2’和80kD的Ln-5c2x片段，或者在VM形成的信号传导最后阶段，MMP-14的表达和活化将proMMP-2转化为活性MMP-2，两者结合促使层粘连蛋白5g2链被切割成g20和g2x片段等，通过以上这些片段增加表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和肌动蛋白丝的表达引起细胞骨架重组和运动等促进VM的形成[7,12]。另外，MMP-2与表皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）共同作用也能辅助于抗肿瘤药物停用之后的肿瘤侵袭能力的恢复和增加，以及VM的形成[13]，但是其机制还不清楚。此外，MMP-9和MMP-7等在促使VM的形成中也起到一定的作用[7]。因此，VM的形成对MMPs有一定的依赖性，MMPs也可能成为抗VM形成的关键靶点。

2.2.2 HIF-1α 和HIF-2α

HIF-1α是由缺氧的肿瘤微环境诱导表达并参与VM形成的一个重要信号分子。HIF-1α与肿瘤中VM的密度呈正相关性，并影响肿瘤的进展和患者预后。W Li[14]等人首次应用VM阳性的结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞模型证明CRC中EMT、HIF-1α和VM之间的相关性。其关系为缺氧环境引起HIF-1α表达增加，HIF-1α促使EMT相关的紧密连接蛋白4（claudin-4）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vim）等的相关基因表达增加，进而促进EMT；EMT作为VM形成的基础促进VM的形成，并且两者之间存在协同作用[14]。随后，在肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中发现赖氨酰氧化酶2（lysyl oxidases like 2， LOXL2）是HIF-1α调节EMT和VM之间关系的必需物质。HIF-1α诱导LOXL2蛋白表达，LOXL2促使E-cadherin的丢失和波形蛋白表达的上调，从而促进VM形成。就此，在基因检测分析中发现LOXL2的相关差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）中解螺旋酶转录因子（helicase like transcription factor, HLTF）、CENPF、异常纺锤体样小头畸形相关蛋白（abnormal spindle-like microcephaly-associated protein, ASPM）、NIPBL（nipped-B-like, NIPBL）、丝氨酸/苏氨酸激酶20样激酶（STE20 like kinase，SLK）、磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶C2结构域的α多肽（Phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing alpha polypeptide ，PIK3C2A）、染色体维持蛋白2（structural maintenance of chromosomes 2，SMC2）、TATA-盒结合蛋白相关因子9b（TATA-box binding protein associated factor 9b，TAF9B）和三磷酸腺苷酶家族蛋白2（ATPase family, AAA domain containing 2，ATAD2）的表达明显升高[15]。因此，LOXL2可能通过以上DEGS促使VM的形成，但是其中的精细分子通路还不清楚。再者，HIF-1α可能参与神经营养因子neuritin 1在体外和体内的过表达，并可能通过与其配体的相互作用促使VM的形成[6]；或参与驱动HCG的过度表达以及作为巨噬细胞参与体内VM形成的关键因子（有利于巨噬细胞形成VM的初始和具有灌注功能网络结构）[9,11,16]等。因此HIF-1α是缺氧环境中诱导VM形成不可或缺的重要分子。值得注意的是，HIF-1α参与肿瘤相关免疫细胞形成VM的现象可能暗示HIF-1α参与肿瘤相关免疫细胞在肿瘤中募集的相关信号传导。

另外，在胰腺癌患者中可以检测到VM阳性肿瘤的细胞质和细胞核高表达HIF-2α，增加的HIF-2α通过上调扭曲转录因子（twist-related protein 1，twist1）的表达，之后twist1的P1（-421bp）和P4（-2110bp）结合序列与VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）启动子的结合增加VE-cadherin的表达，VE-cadherin作为VM的关键调节蛋白质，能通过调节凯索依赖性基因表达促进VM形成[17,18]。同时，HIF-2α的表达伴随MMP-2和MMP-9的表达增加，彼此可能具有协同作用。当然，这其中也可能涉及到MMP-14的参与。

2.2.3 HCG

VM具有HCG浓度依赖性。Min Su[11]等人在应用卵巢癌研究VM的实验中构建缺氧条件并使用不同浓度的HCG处理OVCAR-3细胞，发现随着HCG浓度的增加VM的密度增加，并且该作用在5000mU/ml的HCG浓度下诱导效果最佳。随后，在SAINAN GAO[19]的小鼠体内实验中发现增加绒毛膜促性腺激素β多肽5（CGB5）（它是β-HCG的第五个亚基并被鉴定为HCG的关键部分）可以增加上皮卵巢癌中的VM，并伴随着CGB5的受体（黄体生成素受体）表达增加。因此，HCG也有可能通过与其下游受体通路作用促成VM，但是具体途径和机制还不清楚。

2.2.4 lncRNA

多种长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA），如转移相关肺腺癌转录物1（MALAT1）和LINC00339等在肿瘤中高表达，通过诱导促VM形成的相关蛋白表达，或者和miRNA之间共同作用等促进VM的形成，并与肿瘤分期呈正相关性。比如在胃癌中MALAT1的过度表达增加VE-cadherin、β-连环蛋白、MMP-14、MMP-2和MMP-9的表达，并通过细胞外调节的MAP激酶（extracellular regulated MAP kinase ，ERK）/MMP和黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK)/桩蛋白（paxillin）信号通路的作用等[20]共同诱导VM的形成。而在恶性胶质瘤中，过表达的LINC00339和lncRNA HOXA簇反义RNA2（HOXA-AS2）与miRNA作用诱导VM的形成。LINC00339与miR-539-5p结合而下调miR-539-5p并增加twist1的表达，twist1结合MMP-2和MMP-14的启动子区域进一步诱导它们的表达[21]；另外，HOXA-AS2的过度表达增加miR-373的表达，并通过miR-373增加EGFR活性，进而激活PI3K/AKT、增加VE-cadherin、MMP-2和MMP-9的表达和活性[7]。由此看出，lncRNA在基因水平上调节VM的形成具有关键而广泛的作用。

2.2.5 肿瘤相关免疫细胞

肿瘤能招募肿瘤相关免疫细胞[16]，如肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages，TAM），并通过它们促使VM的形成。TAM通过环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）激活诱导多形性成胶质细胞瘤的VM形成[6]。在多形性成胶质细胞瘤中，巨噬细胞在VM阳性区域浸润增加，通过高度表达COX-2激活前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）/假 定 蛋 白 质 1（hypothetical protein 1，EP1）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）途径促使VM形成，因此COX-2可能是VM的必需物质。在该机制的研究中发现VM相关的TAM表现为M2型，并高度表达CD68和CD206；再者，用IL-4激活的TAM表现出CD68、Arg-1和CD204的m-RNA水平显著增加[6]。这些表现可能与肿瘤VM局部微环境的刺激有关。另外，有研究证明TAM形成VM的初始结构必需HIF-1α的参与[9]，但是其机制尚不清楚。而在食管癌中，CD66b +肿瘤浸润性嗜中性粒细胞（tumor-infiltrating neutrophil，TIN）通过自身和肿瘤细胞在肿瘤微环境中的相互作用诱导VM形成。这其中的机制可能是在肿瘤微环境中招募的TIN诱导食管癌细胞发生EMT而起作用[22]。但让人好奇的是在肝癌中发现成纤维细胞旁分泌的转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）能诱导VM形成[23]，这其中的机制可能涉及到分泌TGF-β的相关免疫细胞与肿瘤的相互作用，也可能隐藏着其它促肿瘤相关免疫细胞通过彼此之间的联系促进VM形成的重要机制。

2.2.6 自分泌信号传导通路

EM Langer[8]等人在研究抑制锌指E盒结合同源框1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）的miRNA对VM的形成抑制时发现在Claudin-low癌细胞系中VM的形成涉及自分泌信号传导通路。自分泌信号传导通路响应于营养缺乏而促进VM的形成，其主要机制为通过高表达自分泌信号传导因子纤连蛋白1（fibronectin 1 ，FN1）和丝氨酸蛋白酶抑制剂（丝氨酸蛋白酶）家族E成员2 [serine protease inhibitor (serpin) family E member 2，SERPINE2]，以及其受体整合素β1（integrin beta 1，ITGB1）和低密度受体相关蛋白（low-density lipoprotein recepor-related protein 1，LRP1）等。FN1和SERPINE2通过与细胞表面受体ITGB1和LRP1相互作用响应于营养缺乏而诱导VM形成。而SERPINE2能诱导细胞的自分泌功能，因此该机制可能存在自身放大的效应而增加对营养缺乏的响应。另外，该实验首次证明抑制ZEB1的miR-200c所引起的白细胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte peptidase inhibitor，SLPI）、趋化因子（C-X-C基序）配体1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]或白细胞介素8对形成VM的细胞内在和自分泌信号的调节无显着贡献，否定了之前的相关报道结果。当然，这种差异是否由于实验条件的影响，还有待进一步证实。

2.2.7 细胞周期依赖性激酶5

细胞周期依赖性激酶5（cyclin dependent like kinase 5，CDK5）通过FAK/蛋白激酶B（protein Kinase B，AKT）信号传导途径控制非小细胞肺癌中的血管生成拟态形成[24]。该实验证实CDK5调节FAKSer732和AKTSer472磷酸化水平，并通过FAK引起紧凑和定向的纤维状F-肌动蛋白排列致使细胞骨架转化促进VM的形成。并在体内和体外应用CDK5的抑制剂证实CDK5抑制能有效抑制VM的形成。然而，关于CDK促进VM形成的机制了解甚少，其中的具体机制还有待进一步探索。

2.2.8 其他

二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1（recombinant dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，DDAH1）在乳腺癌中促进VM，以及DDAH1的3’UTR是miR-193b的直接靶标之间的相互关系[25]。在VM阳性的肿瘤中经常发现MIG-7 mRNA的高表达，而VE-cadherin表达与MIG-7mRNA之间存在正相关性。MIG-7在肿瘤组织中的高表达以及VE-cadherin的高表达可能具有促进VM形成的协同作用[26]。再者，CD147[27]、水通道蛋白-1[28]、几丁质酶3[29]、Dickkopf-1[30]、瘦素[31]和高迁移率族蛋白A2[32]等在肿瘤中促进VM的形成等。但是其中许多只是在临床患者标本中观察到相关的现象，其中的机制还不清楚。

3 问题与展望

本文综述近年肿瘤促进VM形成的部分研究进展。但关于VM形成机制的研究还没有完全阐明，比如缺氧环境诱导的相应信号（比如HIF-1α和HIF-2α等）所起的调控作用复杂而广泛，涉及到蛋白、激素和免疫细胞等，由于缺氧是肿瘤微环境中最常见的现象之一，进一步研究精细调控通路是有必要的。再者，肿瘤通过何种机制促使lncRNA的过表达，lncRNA与miRNA之间促进VM形成存在怎样的机制，鉴于lncRNA调节信号的多样性，lncRNA与其他信号通路之间是否还存在联络等还有待研究；而更加值得注意的是，肿瘤相关免疫细胞在VM形成中的作用。现有的研究已经证明肿瘤相关免疫细胞的免疫抑制促进肿瘤发展[33]，如何寻找两者之间的相关性存在一定的研究应用价值等。虽然目前也有针对抑制VM的研究包括应用通过纳米技术递送抗肿瘤药物或基因[34]和应用中草药抑制VM的相关信号[23]等的研究取得了一定的效果，但是其中也发现抑制VM的抗肿瘤药物会引起肿瘤耐药性。该如何结合药物和调控耐药之间的关系以达到抑制VM的形成还遗留着诸多问题待解决。然而，针对于VM的促肿瘤发生和进展的作用，有效阻断VM的形成在防治和抗肿瘤形成中可能会起到关键性作用，具有重要的潜在研究价值。