探究pH对酶活性的影响的实验改进与延伸

程宏��

摘要：对“pH对酶活性的影响”探究实验的实验材料、实验原理、实验方案、操作步骤、实验拓展的充分思考与设计更有利于探究活动的科学、开放和深入。

关键词：pH；酶活性；过氧化氢；过氧化氢酶

研究背景

影响酶活性的条件很多，其中“pH对酶活性的影响”就是高中生物中学生需要探究的一个主题。如果仅仅按照常规的教学安排，将使得探究实验成为验证实验或者仅仅是操作技术的模仿。如何使得整个探究活动更为科学、开放和深入呢？笔者在实际的教学中有以下探究与思考：

教学设计

一、 课前分组设计“探究pH对酶活性的影响”实验方案

实验材料：过氧化氢溶液、过氧化氢酶溶液（动植物组织提取液）、淀粉溶液、淀粉酶溶液。

实验器材：满足方案需求。

二、 课上分组交叉讨论实验方案，关注以下几个主题

1. 选择什么样的实验材料更合适？

实验中需要加入盐酸和氢氧化钠以调节pH值，那么毫无疑问，需要考虑pH（酸碱度）对反应底物分解的影响，按照教材中的建议，“用过氧化氢酶探究pH对酶活性的影响”而不采用“淀粉酶”。原因是淀粉会在酸性条件下进行水解，从而影响实验结果，干扰对实验结果的分析，无法作出“pH对酶活性影响”的相关结论。

2. 如何设定合适的梯度区间？

那么，使用过氧化氢酶（CAT）探究pH对酶活性的影响是不是就不用考虑pH对过氧化氢分解的影响了呢？教师演示实验：向过氧化氢溶液中添加强酸强碱，观察现象。

过氧化氢是一种二元弱酸，金属过氧化物是它的正盐。

实验室制取过氧化氢就是利用强酸制弱酸原理：

H2SO4+BaO2H2O2+BaSO4↓

过氧化氢在强酸性条件下（pH<3）稳定性较差，表现很强的氧化性，能够使得蛋白质分子的氨基酸残基被氧化。如，半胱氨酸的巯基容易被氧化，如果酶的活性位点是半胱氨酸，氧化后则失活，如果其他位置的半胱氨酸被氧化，则形成其他二硫键影响蛋白质的空间结构。

过氧化氢在弱酸条件下比较稳定，一般商品的过氧化氢溶液里都加有酸作为稳定剂，它的pH值约在4左右。当pH值在5～7时，其分解有所加快。

过氧化氢在强碱性条件下不稳定，表现为还原性，分解速度加快。因为在此条件下，容易形成HO-2离子。而HO-2是一种亲核试剂，会继续引发过氧化氢分解。其反应如下：

H2O2H++HO-2

当pH>11时过氧化氢分子大部分以过氧氢阴离子（HO-2）形式存在，所以此时溶液的稳定性很差，且随着pH值的升高，稳定性下降，分解速度更快。

因此，如果用过氧化氢酶探究pH对酶活性的影响就需要对pH的范围进行设定，不要过酸或者过碱，从而针对性地探究出pH对酶活性的影响。

3. 用三种实验操作方法的差别到底是控制无关变量还是自变量？

搜集学生的实验设计方案，分析比较各方案的差异：

方案一：向3支盛有酶溶液的试管中加入已经稀释待用的盐酸溶液（pH为4、5、6）2mL，充分混匀后，各自加入2mL过氧化氢溶液，振荡，观察比较气泡的产生速率。

方案二：先将酶溶液加入过氧化氢溶液中，在酶和底物的反应体系中快速加入已经稀释待用的盐酸溶液（pH为4、5、6）2mL，振荡，观察比较气泡的产生速率。

方案三：向3支盛有酶溶液的试管和3支盛有底物溶液的试管中分别加入已经稀释待用的盐酸溶液（pH为4、5、6）2mL，充分混匀后，将两支试管的内容物混合在一起，观察比较气泡的产生速率。

对于方案一来说，虽然过氧化氢酶被不同pH处理过，但是当过氧化氢酶溶液与过氧化氢溶液混合时，pH已经明显发生改变。在未知pH对酶活性影响是否具有可逆性时，这种做法是违背控制性原则的。

由于酶具有高效性，方案二中，气泡的产生速率很快，加入不同pH的盐酸溶液已经看不出明显差异。

只有方案三，由于底物与酶分别处理，所以很好地控制了pH误差，pH是本实验的自变量，而不是无关变量。操作方法体现了实验者对实验自变量的操控而不是对无关变量的控制。

三、 课堂分组实施实验方案，围绕操作与装置提出问题

1. 可以用梯度稀释法配制不同pH的盐酸溶液

借鉴微生物分离纯化与计数中的“梯度稀释”方法可以获得不同浓度梯度NaOH溶液和HCl溶液，具体方法是：用微量移液器吸取1mL的浓盐酸，加入盛有11mL蒸馏水的1号试管中，振荡混匀，此时溶液pH为3；更换枪头，在1号试管中吸取1mL的溶液，加入盛有9mL蒸馏水的2号试管中，振荡混匀，此时溶液pH为4；以此类推可以配制溶液pH为5、6的盐酸溶液（注意不能配制得到pH为7的溶液，直接使用蒸馏水）。

2. 反应的观测指标是什么？酶促反应速率就是酶活性吗？

无论是观察气泡的释放速度，还是观察有色液滴的移动距离，以这些为标准，衡量酶促反应速率。但是酶促反应速率并不等同于酶活性。酶活性是酶的一个屬性，影响酶活性的因素一定影响酶促反应速率，比如温度、pH、非竞争性抑制剂。反之，影响酶促反应速率的因素不一定影响酶活性，比如酶浓度、底物浓度。

四、 课后反思实验拓展

1. 这个实验究竟能不能找到“最适”呢？

严格地说，通过具体的实验是不能够找到所谓“最适”的，即使很小的梯度范围。但是，我们可以确定“通过该实验得到的最适”或者“最适的区间”。

2. 为什么肝脏研磨液可以催化过氧化氢的分解呢？

在真核细胞中普遍存在着过氧化物酶体（微体），在肝细胞和肾细胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶、过氧化氢酶。其中的氧化酶可以催化过氧化氢的产生，过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，能够催化过氧化氢的分解，从而使细胞免受过氧化氢的毒害。

3. pH是怎样影响酶活性的？可以恢复吗？

pH影响酶活性的原因可用以下两个方面加以理解：

（1）过酸、过碱可以破坏酶的空间结构，使酶失活，这样的破坏是不可逆转的；

（2）当pH改变不是很剧烈时，pH造成影响可以这么分析：

①影响底物的解离状态，使底物不能和酶结合或者结合以后不能生成产物；

②影响酶活性部位有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化；各种酶在维持最适pH时所处的某种解离状态，最有利于与底物结合并发生催化，如胆碱酯酶解离成两性离子、精氨酸酶呈负离子时活力最大；

③影响到中间产物ES的解离状态，不利于催化产物生成。

在相对微小的范围中，pH对酶活性造成的影响是可以恢复的，正像酸碱缓冲剂中提取或保存酶溶液是一个共识的道理一样。

4. 对于无关变量的控制“相同、等量”且“适宜”是否需要“预实验”？

事实上，温度对过氧化氢酶的活性是有非常大的影响的，不同温度条件下得到的结果是有差异的。好在过氧化氢酶在本地室温（实验室夏季最高28℃，冬季22℃）下都能够很好地发挥作用，因此一般并没有进行预实验。但值得注意的是，如果多个无关变量影响着实验结果的话，就需要逐一找到“适宜”，比如：酶浓度、底物浓度等等。

参考文献：

[1]汪堃仁.细胞生物学.北京：高等教育出版社，1991.

[2]翟中和.细胞生物学.北京：高等教育出版社，2001.

作者简介：

程宏，安徽省黄山市，歙县长青中学。endprint