ELISA双抗体夹心法检测嗜铬蛋白A的性能评价及临床应用

胡玉懿， 吴 蕙， 韩 序， 张春燕， 郭 玮， 楼文晖， 潘柏申

（1. 复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2. 复旦大学附属中山医院普外科，上海 200032）

嗜铬蛋白A（chromogranin A，CgA）属于嗜铬蛋白家族，存在于所有神经内分泌细胞内能分泌儿茶酚胺的囊泡中[1]，是一个相对分子质量为48 000的酸性、亲水性、可溶性蛋白质，最初在肾上腺嗜铬颗粒中，其与儿茶酚胺及钙等是共分泌的[2]。在CgA上有很多碱性氨基酸对，是潜在的激素原转化酶切位点，且很多酶切产物已被鉴定，其中有些产物具有生物学功能。近年来有很多研究表明，在多种病理、生理状态下，CgA及其衍生片段在组织中含量升高，发挥抑制性生理功能或作为疾病诊断的标志物[3]。神经内分泌肿瘤是起源于神经内分泌细胞的肿瘤。神经内分泌细胞是机体内具有神经内分泌表型，可以产生多种激素的一大类细胞。神经内分泌细胞遍布全身各处，因此神经内分泌肿瘤可以发生在体内任何部位，但胃、肠、胰腺等消化系统神经内分泌肿瘤最常见，约占所有神经内分泌肿瘤的2/3[4]。国外有研究结果显示，几乎所有类型的神经内分泌肿瘤患者都会有血浆或血清CgA水平的升高[5]，因此在神经内分泌肿瘤的诊断中，CgA是极具有诊断价值的非特异性肿瘤标志物[4，6-8]。本研究对酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）双抗体夹心法检测CgA进行性能验证，并对其临床应用价值进行初步评估。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2011年10月—2015年6月复旦大学附属中山医院临床病理诊断为神经内分泌肿瘤的患者66例作为神经内分泌肿瘤组，其中胰腺神经内分泌肿瘤39例、胃神经内分泌肿瘤10例、肠神经内分泌肿瘤15例、肺神经内分泌肿瘤2例。其病理诊断结果均经2名病理科医师确认。66例患者中男25例、女41例，年龄（55.62±11.57）岁。以在复旦大学附属中山医院进行体检的41名健康者为健康对照组，其中男18名、女23名，年龄（43.29±18.69）岁。选取2013年3月—2015年3月复旦大学附属中山医院临床诊断为胰腺肿瘤、胰腺肿物的患者65例作为疾病对照组，其中男31例、女34例，年龄（54.49±12.36）岁。

1.2 试剂

采用法国Cisbio Bioassays公司的ELISA试剂盒手工检测CgA，试剂批号为41X和43D。

1.3 检测性能评价

1.3.1 精密度的验证 根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） EP15-A文件[9]，将3个水平混合样本（S1、S2、S3）分别重复检测20次，计算批内均值和变异系数（coefficient of variation，CV）；将3个水平混合样本每日检测2个批次，每批次各检测2次，连续检测5 d，计算批间均值和CV。

1.3.2 正确度的验证 测定赋值质控品，计算测定均值与质控品标示浓度的相对偏移。

1.3.3 线性范围的验证 将已确定低值和高值的样本按照一定比例混合稀释，配制成5个等差浓度比例的样本（4L、3L+H、2L+2H、L+3H、4H），“L”为低值样本，“H”为高值样本。按浓度由低到高检测2次，计算均值。以实际均值为Y、理论值为X，拟合一次（Y=aX+b）、二次（Y=aX2+bX+c）、三次（Y=aX3+bX2+cX+d）多项式方程，并参考CLSI EP6-A文件[10]，评估是否为线性。

1.3.4 定量检测下限的评价 参考CLSI EP17-A文件[11]，选择1份接近厂家声明的检测限（7.00 ng/mL）的低水平健康者样本（7.93 ng/mL），测定20次，至少有18次检出为符合要求。

1.4 临床应用评价

比较神经内分泌肿瘤组、健康对照组和疾病对照组血清CgA水平的差异。通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC）来评估CgA对神经内分泌肿瘤患者的诊断能力，获得最佳诊断界值和此时的诊断敏感性、特异性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布的连续计量资料采用x±s表示。偏态分布资料采用中位数（四分位数）[M（P25，P75）]描述，多组之间比较采用Kruskall-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度的验证

ELISA双抗体夹心法检测血清CgA的批内CV＜14.00%、批间CV＜8.00%，均近似厂家提供的CV。见表1。

2.2 正确度的验证

质控品测定值为（80.47±4.13）ng/mL，质控品标示浓度为（77.0±11.6）ng/mL，相对偏移为4.51%。

表1 CgA检测的批内、批间精密度验证结果

2.3 线性范围的验证

一次多项式拟合方程为Y=0.793X-3.791，r2=0.988。二次多项式系数a的P值＞0.05，三次多项式系数a的P值＞0.05，b的P值＞0.05。显示二次、三次多项式系数与“0”无明显差异，说明曲线在8～740 ng/mL范围内呈线性。

2.4 定量检测下限的评价

CgA的检测下限为7.93 ng/mL，检测20次，全部检出，且浓度接近试剂说明书提供的检测限（7.00 ng/mL），符合检测下限要求。

2.5 神经内分泌肿瘤组、健康对照组和疾病对照组之间血清CgA水平的比较

神经内分泌肿瘤组、健康对照组、疾病对照组血清CgA水平分别为71.48（47.79，160.22）、40.85（28.70，62.92）和51.60（33.63，90.37） ng/mL，3组之间差异有统计学意义（P＜0.000 1），且两两之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 各神经内分泌肿瘤患者一般特征和血清CgA水平的比较

图1 3组之间血清CgA水平的比较

2.6 血清CgA对神经内分泌肿瘤患者的诊断价值分析

ROC曲线分析显示，血清CgA鉴别正常人和神经内分泌肿瘤患者的AUC为0.741。以敏感性与特异性之和最大时的值为最佳诊断界值，血清CgA在最佳诊断界值为47.18 ng/mL时的诊断敏感性为78.8%，特异性为68.3%。见图2。

图2 CgA鉴别正常人和神经内分泌肿瘤患者的ROC曲线

3 讨论

CgA存在于多种动物的内分泌组织和神经内分泌细胞内的嗜铬颗粒中，由439个氨基酸组成，成熟的CgA被糖基化、硫酸化修饰，是一种酸性糖蛋白，等电点在5.0左右。CgA具有不同的蛋白酶水解位点，在不同内分泌组织中被水解为具有不同抑制作用的活性片段，参与激素的调节。目前已经明确，CgA是国际公认的神经内分泌肿瘤的非特异性指标，可以辅助诊断神经内分泌肿瘤，由于其存在于绝大多数神经内分泌肿瘤中并释放入血循环，所以神经内分泌肿瘤患者的CgA水平会有大幅度升高[12-16]。

检测CgA的方法包括放射免疫法和ELISA。本实验室采用国内文献报道较多的Cisbio Bioassays公司的ELISA试剂盒进行手工检测，参考CLSI文件进行部分调整后对CgA的精密度、正确度、线性范围和定量检测下限的分析性能进行评价。结果显示，该方法精密度良好（批内CV＜14.00%、批间CV＜8.00%），都近似于厂家提供的CV；在正确度验证中，质控品实测浓度皆在质控品标示浓度范围内，实测均值与靶值的偏移＜5.00%；该方法的线性范围是8～740 ng/mL；定量检测下限（7.93 ng/mL）也接近厂家提供的性能参数，符合临床检测要求。

神经内分泌肿瘤是起源于弥散神经内分泌系统的一组异质性肿瘤群，可发生在身体各个部位。目前，多数学者都不认为神经内分泌肿瘤是一种罕见疾病。亦有文献指出，在胃肠道肿瘤中，神经内分泌肿瘤的发病率仅次于结直肠癌，比胃癌、胰腺癌、食管癌以及肝胆癌更常见[14]。有多篇文献曾报道，血清CgA被认为是包括美国在内的部分西方国家诊断胃肠神经内分泌肿瘤的有用标志物[4，17-18]，而在亚洲神经内分泌肿瘤人群中也得到类似的结论[19-22]。并且，CgA水平的异常升高是推断神经内分泌肿瘤为局灶性还是已发生转移的重要依据，经手术治疗的神经内分泌肿瘤患者，血清CgA水平则相应降低[23]。因此，血清CgA不仅是神经内分泌肿瘤辅助诊断的标志物，还可以作为肿瘤治疗过程的动态监测和判断预后的指标。亦有报道证明，在嗜铬细胞瘤和功能性良性肿瘤上，CgA的敏感性比24 h尿5-羟基吲哚乙酸更高[24]。

本研究结果显示神经内分泌肿瘤患者血清CgA水平明显高于健康对照组（P＜0.001 0），神经内分泌肿瘤患者和疾病对照组的血清CgA水平也有差异（P=0.014 5），提示CgA可以为神经内分泌肿瘤的诊断提供帮助。

ROC曲线分析显示，血清CgA鉴别正常人和神经内分泌肿瘤患者的最佳诊断界值为47.18 ng/ mL，诊断敏感性为78.8%，特异性为68.3%。

综上所述，ELISA双抗体夹心法定量检测CgA的各项检测性能均符合临床要求。对CgA初步临床应用的研究显示，血清CgA是诊断神经内分泌肿瘤的有用标志物，CgA水平在神经内分泌肿瘤患者中显著升高，可以为临床提供有用的诊断参考。但本研究未分析CgA对神经内分泌肿瘤的预后作用，这也是之后研究的方向。

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