抗氨甲酰蛋白抗体与类风湿性关节炎的相关性分析

陈燚琼， 赵 迪， 任 方， 邓晓刚， 徐 龙， 李 智

（同济大学附属杨浦医院检验科，上海 200090）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，其特征是持续滑膜炎、全身性炎症，血清中多可检出自身抗体。RA的病因和发病机制目前仍知之甚少。及时诊断、及早治疗对于RA的控制具有重要意义。迄今的研究已经证实，对RA特异性最高的自身抗体是针对含瓜氨酸表位蛋白的自身抗体，这些抗体被称为抗瓜氨酸蛋白抗体（anti-citrullinated protein antibody，ACPA）。ACPA阳性和ACPA阴性的RA患者在遗传基因、环境危险因素、疾病的进展和缓解等方面都有所不同[1-2]。过去几年的研究主要聚焦于ACPA阳性RA患者的病因学、病情进展和治疗等方面，而对ACPA阴性的RA患者研究较少。近年有报道称在RA患者体内检测出一种新的自身抗体系统——抗氨甲酰蛋白（carbamylated protein，Carp）抗体[3]。该抗体不仅能在ACPA阳性的RA患者血清中被检测到，约有30%的ACPA阴性患者也能检测到。本研究通过检测RA患者血清中抗CarP抗体水平，初步探讨抗CarP抗体在RA诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 RA组 选取2014年1月—2015年12月在同济大学附属杨浦医院风湿科就诊的门诊及住院RA患者102例作为RA组，所有患者均符合2010年美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）制定的RA分类标准，其中男 34例、女68 例，年龄（61.2±12.2）岁。

1.1.2 非RA组 选取同期同济大学附属杨浦医院风湿科除RA外的其他风湿性疾病患者55例作为非RA组，其中男13例、女42例，年龄（53.2±13.1）岁，包括系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE） 14例、原发性干燥综合征（Sjögren syndrome，SS）15例、强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）8例、骨性关节炎（osteoarthritis，OA）7例、痛风性关节炎2例、其他结缔组织病9例。以上病例均符合相应的专业诊断标准。

1.1.3 健康对照组 选取同期同济大学附属杨浦医院体检健康者83名作为健康对照组，其中男32名、女51名，年龄（58.7±11.8）岁。

1.2 试剂与检测方法

1.2.1 试剂 牛血清白蛋白V、氰酸钾和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔抗人IgG、IgA均购自美国Sigma公司。

1.2.2 检测方法 采集患者及健康对照组人群空腹静脉血5 mL，离心后分装血清，置于-80 ℃低温冰箱中保存待测。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）检测抗Carp抗体，参照文献[3]进行操作，用生理盐水溶解牛血清白蛋白V，使其终浓度为4 mg/mL，加入1 mol/L氰酸钾，37 ℃孵育12 h，用去离子水透析除盐，以1 500×g离心15 min去除沉淀物，上清即为含高瓜氨酸残基的牛血清白蛋白。用pH值9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释蛋白浓度至10 μg/mL，包被96孔微孔板，50 μL/孔，4 ℃放置过夜，用含0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）洗涤3次，用含1%牛血清白蛋白的PBS封闭微孔，100 μL/孔，充分洗涤后，拍干备用。待测血清标本用含0.05%Tween20和1%牛血清白蛋白的PBS作50倍稀释，以50 μL/孔剂量加入已包被好的微孔板中，室温孵育2 h，用上述洗涤缓冲液洗涤后，加入稀释好的HRP标记的兔抗人IgG （50 μL/孔），室温孵育2 h。充分洗涤并常规显色，读取各孔吸光度（A）值。每份标本均设复孔。将复孔A均值转换为任意单位aU/mL，临界值为健康对照的x ±2s。抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体采用Cobas e601电化学发光分析仪（德国罗氏诊断有限公司）及配套试剂检测，类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、补体（complement，C）3、C4、IgG、IgA、IgM采用BNⅡ特定蛋白分析仪（德国西门子医学诊断产品有限公司）及配套试剂检测。

1.2.3 抗Carp抗体检测方法的性能 抗Carp IgG抗体批内精密度低值为8.06%，高值为5.92%；批间精密度低值为7.52%，高值为5.34%；检测范围为1.27～15.08 U/L。抗Carp IgA抗体批内精密度低值为7.62%，高值为6.18%；批间精密度低值为7.02%，高值为5.91%；检测范围为1.00～13.32 U/L。抗Carp抗体的检测结果不受黄疸（胆红素＜302 μmol/L）、溶血（血红蛋白＜4.76 g/L）和脂血（甘油三酯＜5.14 mmol/L）的影响。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析和两两比较的q检验，2个组比较采用t检验。非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用例数（率或构成比）表示，组间比较采用χ2检验，变量之间相关性分析采用Spearman相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA组、非RA组、健康对照组血清抗Carp抗体水平及阳性率的比较

RA组血清抗Carp IgG抗体水平为（8.60±2.64） U/L，阳性率为42.16%，抗Carp IgA抗体水平为（6.65±3.09） U/L，阳性率为46.08%，均高于非RA组和健康对照组（P＜0.05）；非RA组抗Carp IgG抗体、抗Carp IgA抗体水平和阳性率亦高于健康对照组（P＜0.05），见表1、表2。将健康对照组抗Carp IgG抗体、抗Carp IgA抗体水平的x ±2s视为阳性阈值，计算出抗Carp IgG抗体对RA的诊断敏感性为42.16%，特异性为89.13%；抗Carp IgA抗体对RA的诊断敏感性为46.08%，特异性为86.96%。并根据此标准将RA组分为抗Carp抗体阳性组和抗Carp抗体阴性组。

2.2 抗CCP抗体阴性RA患者中血清抗Carp IgG抗体、抗Carp IgA抗体的阳性率

在RA患者中，抗CCP抗体和抗Carp IgG抗体均阴性者占7.84%，抗CCP抗体和抗Carp IgA抗体均阴性者占9.80%。在抗CCP抗体阴性的RA患者中抗Carp IgG抗体的阳性率为46.67%，抗Carp IgA抗体的阳性率为33.33%。

表1 RA组、非RA组、健康对照组血清抗Carp IgG抗体水平和阳性率比较

表2 RA组、非RA组、健康对照组血清抗Carp IgA抗体水平和阳性率比较

2.3 RA患者抗Carp抗体与相关实验室指标的关系

2.3.1 抗Carp抗体水平与RA相关实验室指标的关系 抗Carp IgG抗体阳性和阴性RA患者性别、年龄、C3、C4、RF和抗CCP抗体差异均无统计学意义（P＞0.05），而IgG、IgA和IgM差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。抗Carp IgA抗体阳性和阴性RA患者性别、年龄、C3、RF和抗CCP抗体差异均无统计学意义（P＞0.05），而IgG、IgA、IgM和C4差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.3.2 抗Carp抗体与RA相关实验室指标的相关性分析 RA患者抗Carp IgG抗体与年龄、病程、RF、抗CCP抗体、C3和C4无明显相关性（P＞0.05），但与IgG、IgA和IgM呈正相关（r值分别为0.077、0.162和0.133，P＜0.05）；抗Carp IgA抗体与年龄、病程、RF、抗CCP抗体、IgM和C4无明显相关性（P＞0.05），但与IgG和IgA呈正相关（r值分别为0.045、0.333，P＜0.05），与C3呈负相关（r=-0.049，P＜0.05）。

表3 血清抗Carp IgG抗体阳性组与阴性组RA患者实验室指标的比较

表4 血清抗Carp IgA抗体阳性组与阴性组RA患者实验室指标比较

3 讨论

氨基甲酰化是一个非酶促的化学反应过程，在这个反应中，氰酸盐介导赖氨酸转变为高瓜氨酸。氰酸盐是氨基甲酰化必需的物质，其在人体内天然存在且与尿素保持平衡[4]。在生理状态下尿素的水平相当低，蛋白的氨基甲酰化也处于低水平。但特殊情况下，尤其是长半衰期的蛋白如基质分子易发生氨基甲酰化。肾功能衰竭时，由于尿素水平升高，蛋白的氨基甲酰化也同步增加[5]；吸烟作为RA最主要的环境危险因子，可能通过增加氰酸盐的水平来提高氨基甲酰化水平[6]；慢性炎症会发生广泛的氨基甲酰化，因为中性粒细胞释放过氧化物酶，该酶能将硫氰酸盐转化为氰酸盐[6]。吸烟和慢性炎症是RA重要的致病因素，由此提示蛋白的氨基甲酰化可能参与了RA的发病机制。

SHI等[3]发现有45%的RA患者抗Carp IgG抗体阳性，有43%的RA患者抗Carp IgA抗体阳性，而且重要的是约有16%的ACPA阴性RA患者可检测到抗Carp IgG抗体，30%的ACPA阴性患者可检测到抗Carp IgA抗体，抗Carp抗体与疾病的严重程度，主要是更高的关节损伤率有关。但有关抗Carp抗体与RA相关实验室指标之间的关系尚未见报道，关于抗Carp抗体对RA诊断的特异性国外报道也很少，国内未见报道，而且国外研究对象主要为高加索人种。为此，本研究探讨了抗Carp抗体在我国RA患者中的表达情况。

本研究结果显示RA组血清抗Carp IgG抗体、抗Carp IgA抗体的水平和阳性率均高于非RA组和健康对照组（P＜0.05）。抗Carp IgG抗体对RA的诊断敏感性为42.16%，特异性为89.13%；抗Carp IgA抗体对RA的诊断敏感性为46.08%，特异性为86.96%。其诊断敏感性与SHI等[3]、SCINOCCA等[7]的研究结果基本一致，诊断特异性稍低于SCINOCCA等[7]的报道，可能与RA对照组中纳入的病种和病例数不同有关，也可能与地域及研究对象的遗传背景不同有关。本研究结果还表明抗CCP抗体阴性的RA患者抗Carp IgA抗体的阳性率为33.33%，与文献报道[3-8]一致；抗Carp IgG抗体的阳性率为46.67%，高于SHI等[3]的报道。结果不一致的原因可能与RA组纳入的病例病程不同有关。SHI等[3]的研究对象为病程＜2年的RA患者，随访1年，本研究对RA患者的病程未作严格的限制，有的病程长达30年。

本研究对抗Carp抗体与其他实验室指标进行了分析，结果发现抗Carp IgG抗体阳性组IgG、IgA、IgM水平均明显高于抗Carp IgG抗体阴性组，抗Carp IgA抗体阳性组IgG、IgA、IgM水平均明显高于抗Carp IgA抗体阴性组，C4水平均明显低于抗Carp IgA抗体阴性组；并且相关性分析也表明，抗Carp IgG抗体与IgG、IgA和IgM呈正相关，抗Carp IgA抗体与IgG和IgA呈正相关。这些结果提示抗Carp抗体可能与疾病的进展有关，其作为RA诊断和鉴别诊断及预后评估的血清学标志物的临床意义值得进一步研究。同时抗Carp抗体是否与疾病的严重程度，即与患者的临床指标如影像学表现、病情活动指数——RA疾病活动性评分系统等相关也值得关注。

综上所述，RA患者血清中可以检测到抗Carp抗体，对诊断RA有一定的敏感性和较高的特异性，尤其是在抗CCP抗体阴性的RA患者中也有一定的检出率，这有助于抗CCP抗体阴性RA的诊断，提示其与抗CCP抗体、RF联合检测有助于提高RA的诊断率，且抗Carp抗体与疾病严重程度有一定的相关性，可作为临床上诊疗RA的一个新的血清学指标。进一步研究抗Carp抗体的应用价值对于研究RA的发病机制及诊疗方法具有重要的意义。

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