小麦条锈菌效应蛋白原核表达、纯化及其溶解性研究

赵海斌，王媛媛，陶 虎

(1.西北农林科技大学 化学与药学院；2.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100)

由专性寄生型真菌条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritic,Pst)引起的小麦条锈病是一种气传病害，不仅是一种重要的世界性病害，也是长期影响中国小麦安全生产的严重生物灾害，一般流行年份可以造成约10%～30%产量损失，即年均约1亿人的口粮损失，特大流行年份减产可达60%以上，甚至使小麦颗粒无收。作为活体营养型的锈菌在侵害寄主的过程中，形成与寄主细胞有着非常紧密联系的唯一侵染结构——吸器。病原锈菌可以通过吸器从寄主细胞获取营养物质[1]，同时通过吸器向寄主细胞分泌大量的效应蛋白以抑制寄主的防御反应，这对锈菌的成功入侵至关重要。Voegele研究小组克隆鉴定青豆锈菌吸器分泌蛋白RTP1，是首例被证明在植病亲和互作中于吸器特异表达，然后转移到寄主细胞内的效应蛋白[2]。亚麻锈菌的AvrM和AvrL567效应蛋白在病原菌侵染的过程中也从吸器被转运到寄主的细胞中，并且AvrM和AvrL567在不依赖病原菌转运系统的情况下也能够进入寄主细胞，它们的跨膜转运依赖于其N端的转运信号，说明它们的转运可能是利用寄主细胞的转运机制[3]。

虽然现有研究已经表明吸器与寄主细胞之间存在大量分子转运，但目前对绝大多数效应蛋白的转运机制和致病机理仍不清楚。虽然在AvrL567氨基酸序列上找不到任何同源的结构域信息，但根据三维结构的拓扑学相似性在PDB数据库中找到一个可能具有同样功能的小麦褐斑病菌的毒素蛋白ToxA。而ToxA具有一个Arg-Gly-Asp结构域，可以被寄主细胞膜上的类似整合素样受体识别，经过胞吞作用进入寄主细胞，这个结果暗示AvrL567可能的转运机制[4]。对AvrM的结构研究揭示它能形成一个二聚体蛋白且具有一小块保守的疏水表面，可以跟质膜结合，对于该蛋白为什么在不依赖病原转运系统的时候也能进入寄主细胞有了更深的认识[5]。而这两项研究充分说明蛋白质结构生物学是开展效应蛋白功能深入研究的重要手段，为揭示效应蛋白的转运机制奠定基础，对解析锈菌的致病机理具有重要意义。

目前，可以使用蛋白质结构生物学方法来解析效应蛋白的结构，通过比对已有的蛋白质结构数据库(Protein Data Bank)，找到相似的结构域，来推理效应蛋白的功能，之后通过生化方面的方法来验证[6]。本文初步对3个小麦条锈菌效应蛋白进行原核表达、纯化以及溶解性研究，为核磁共振法或X-射线晶体衍射法解析其蛋白质结构[7]和研究小麦条锈菌侵染机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

表达载体pET-22b(+)、pET-32a-pp (+)、大肠杆菌菌株Turbo、BL21(DE3)都由西北农林科技大学化学与药学院蛋白质三维结构实验室保存并改造；效应蛋白模板由西北农林科技大学康振生教授馈赠；Taq酶、PCR Mix、限制性内切酶(NdeⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ)、TA克隆试剂盒、T4DNA连接酶均购于宝生物工程 (大连) 有限公司；DNA Marker(DM2000)、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒均由北京康为世纪生物科技有限公司提供；蛋白质Marker购于Thermo Fisher Scientific公司；Ni-NTA agarose柱购自美国GE公司；HPLC 的型号FL2200购买于浙江福利分析仪器有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 原核表达载体的构建与鉴定[8]以康振生教授馈赠的质粒为模板，进行PCR扩增获得目的基因 pst-1178、 pst-1374和 pst-8713，并进行TA克隆。使用NdeⅠ和XhoⅠ位点，分别将 pst-1178、 pst-8713与载体pET-22b进行重组，获得重组表达载体pET-22b- pst-1178、pET-22b- pst-8713。使用NcoⅠ和XhoⅠ位点，将 pst-1374与载体pET-32a-pp进行重组，获得重组表达载体pET-32a-pp- pst-1374。将测序正确的表达载体转化BL21(DE3)。

1.2.2 目的蛋白的诱导表达[9]挑取含有重组质粒的BL21单克隆过夜扩大培养，以体积比1∶500 转接至1 L含100 mg Amp的液体LB培养基，37 ℃培养至OD600约0.6～0.8，待培养基冷却至室温后，加入终浓度1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。pET-22b- pst-8713、pET-32a-pp- pst-1374是20 ℃诱导12 h；pET-22b- pst-1178为37 ℃诱导5 h。6 000 r/min，4 ℃ 离心5 min收集菌体后用磷酸盐缓冲液(PBS,20 mmol/L KH2PO4,0.15 mol/L NaCl,pH 7.9)重悬，加入150 μg/mL的溶菌酶，1∶104(核酸酶与裂解液的体积比)核酸酶，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，混合均匀后冰浴30 min，每5 min混匀1次。超声波破碎30 min (250 W，工作5 s，间歇5 s)后。12 000 r/min，4 ℃离心30 min。上清分离SDS-PAGE检测，之后用0.22 μm的聚醚砜膜过滤后，备用。

1.2.3 蛋白质的纯化 目的蛋白pst-1178和pst-8713的纯化：首先用含10 mmol/L咪唑的Tris缓冲液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.9)平衡镍柱(Ni-NTA)，将上述得到的上清液以1 mL/min匀速上样；然后用洗涤溶液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.9)冲洗3～5柱体积，最后用洗脱溶液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.250 mol/L 咪唑，pH 7.9)洗脱目的蛋白。之后测定洗脱的蛋白浓度，把配好的buffer A(φ=0.1% TFA)和buffer B(φ= 0.08% TFA，φ=70%乙腈)分别抽滤后，超声除去气泡。洗脱的目的蛋白先用0.22 μm滤膜过滤，在10 000 r/min离心2 min除去气泡，用HPLC纯化。经Tricine-SDS-PAGE检测蛋白质纯化效果，纯化好的蛋白质样品，用真空冷冻机冻干，得到干粉，-80 ℃保存。

目的蛋白pst-1374的纯化：镍柱纯化方法与蛋白pst-1178和pst-8713一致，然后用洗脱得到的目的蛋白中以体积比1∶100加入自备的Prescission Protease酶[10](1 mg/mL)酶切并用1 L透析液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH 7.9)透析12 h除去咪唑，降低盐浓度。用buffer A (20 mmol/L Tris， pH 7.9)平衡HiTrap Q柱，将透析得到的蛋白液经0.22 nm的聚醚砜膜过滤后用AKTA蛋白纯化系统以0.8 mL/min流速上柱，上完样品后继续以buffer A冲洗10～15 min，直至基线走平。然后以buffer A、buffer B(20 mmol/L Tris，1mol/L NaCl，pH 7.9)进行线性梯度洗脱，经Tricine-SDS-PAGE检测蛋白质纯化效果。给纯化好的蛋白质样品中加入1 mmol/L 苯甲脒和φ=0.02%的NaN3,液氮速冻后-80 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建与鉴定

从长有含重组表达质粒的3个Turbo平板上分别挑取单克隆摇菌并分别提取质粒做PCR检测(图1、图2、图3)条带大小与理论值一致。并送其质粒至华大基因公司测序，结果与目的基因完全一致，表明表达载体pet-22b- pst-1178(图1)、pet-32a-pp- pst-1374(图2)和pet-22b- pst-8713(图3)构建成功。

M. TaKara DL2000 marker；1～4.4个单克隆 PCR products of recombinant plasmids from four different monoclonal cells；5. 阴性对照 Negative control

图1阳性重组质粒pET-22b-pst-1178的菌落PCR
Fig.1PCRproductsofpET-22b-pst-1178recombinantexpressionvectors

M.TaKara DL2000 marker；1. 阴性对照 Negative control； 2～3. 2个单克隆 PCR products of recombinant plasmids from two different monoclonal cells

图2阳性重组质粒pET-32a-PP-pst-1374的菌落PCR
Fig.2PCRproductsofpET-32a-PP-pst-1374recombinantexpressionvectors

2.2 目的蛋白表达与纯化

2.2.1 pst-1178的表达纯化 将诱导表达的菌体破碎，离心后上清过镍柱，将洗脱得到的融合蛋白经HPLC纯化，获得比较纯的目的蛋白(图4)。纯化后蛋白条带与理论值(13 ku)不一致，大约是理论值的3倍。根据其他试验得出效应蛋白pst-1178是以多聚体形式存在于盐溶液中。

2.2.2 pst-1374的表达纯化 将诱导表达的菌体破碎，离心后上清过镍柱，经Elution buffer洗脱得到的融合蛋白约27 ku，用Prescission Protease酶酶切后得到约10 ku蛋白和17.2 ku标签蛋白。由于没有酶切完全，所以图中也有融合蛋白的条带。经HiTrap Q纯化后得到单一条带的电泳纯目的蛋白且分子质量与理论值一致(图5、图6)。

1～2.2个单克隆 PCR products of recombinant plasmids from two different monoclonal cells；3. 阴性对照 Negative control；M. TaKara DL2000 marker.

图3阳性重组质粒pET-22b-pst-8713的菌落PCR
Fig.3PCRproductsofpET-22b-pst-8713recombinantexpressionvectors

1～4.蛋白表达的部分 The parts of expression;1.未诱导的大肠杆菌 The cell lysate before induction；2.IPTG诱导后 The cell lysate after induction；3.超声波碎后的上清 The supernatant；4.离心后的沉淀 The supernatant and pellet of cell lysate；M.蛋白分子量标尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26617)；5～8.镍柱纯化过程 The parts of nickel column purification；5.穿出 Flowthrough of supernatant of cell lysate during loading；6.10 mmol/L 咪唑的洗脱液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8.250 mmol/L 咪唑的洗脱液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；9.HPLC纯化后的电泳纯蛋白 Results of HPLC purification

图4Tricine-SDS-PAGE分析pst-1178效应蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化过程
Fig.4ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-1178onTricine-SDS-PAGE

2.2.3 pst-8713的表达纯化 将诱导表达的菌体破碎，离心后上清过镍柱，经洗脱得到融合蛋白，再经HPLC纯化获得比较纯的目的蛋白，其分子质量与理论值(11 ku)一致(图7)。

1～4. 蛋白表达的部分 The parts of expression；1.未诱导的大肠杆菌 The cell lysate before induction；2.IPTG诱导后 The cell lysate after induction；3.超声波碎后的上清 The supernatant；4.离心后的沉淀 The pellet of cell lysate；5～8.镍柱纯化过程 The parts of nickel column purification；5.穿出液 Flowthrough of supernatant of cell lysate during loading；6.10 mmol/L 咪唑的洗脱液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8.250 mmol/L 咪唑的洗脱液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；M.蛋白分子量标尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26611)

图5Tricine-SDS-PAGE分析pst-1374效应蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化过程
Fig.5ExpressionandpurificationofHis-tagpst-1374onTricine-SDS-PAGE

M.蛋白分子标尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26611)；1.Prescission protease酶 Prescission protease；2.酶切后的蛋白液 Effect of His-pst-1374 digested by prescission protease；3～5.第2次过镍柱纯化过程；3.穿出液 Loading flowt 10 mmol/L imidazole hrough of protease-digested product dialyzed in low imidazole buffer；4.10 mmol/L咪唑 10 mmol/L imidazole；5. 250 mmol/L 咪唑洗脱液 250 mmol/L imidazole lysis buffer； 6～7.阳离子交换柱的结果 Results of Q column；M. 蛋白分子量标尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26630)

图6Tricine-SDS-PAGE分析pst-1374效应蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化过程
Fig.6ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-1374onTricine-SDS-PAGE

1～4. 蛋白表达的部分 The parts of expression；1.未诱导的大肠杆菌 The cell lysate before induction；2.IPTG诱导后 The cell lysate after induction；3.超声波碎后的上清 The supernatant；4.离心后的沉淀 The pellet of cell lysate；5～8.镍柱纯化过程 The parts of nickel column purification；5.穿出液 Flowing through of supernatant of cell lysate during loading；6. 10 mmol/L的咪唑洗脱液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8. 250 mmol/L 咪唑洗脱液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；M1.蛋白分子量标尺(Thermo #26611) Protein molecular weight marker (Thermo #26611);M2.蛋白分子量标尺(Thermo #26617) Protein molecular weight marker (Thermo #26617)；9-10. HPLC纯化后的电泳纯蛋白 Present results of HPLC purification

图7Tricine-SDS-PAGE分析pst-8713
Fig.7ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-8713onTricine-SDS-PAGE

3 结论与讨论

小麦条锈菌效应蛋白，是一类吸器分泌性蛋白，与条锈菌侵染和致病性密切相关。本试验对于效应蛋白的研究，为以后揭开条锈菌侵染途径提供基础。

本研究证实效应蛋白在原核表达系统中可溶性表达。用常规的纯化方法来纯化，可得电泳纯的蛋白质。纯化后3个效应蛋白的水溶性很好，浓缩后都未发生蛋白质沉淀，为下一步通过核磁方法研究效应蛋白结构奠定基础。

在 pst-1178的纯化过程中，发现Tricine-SDS-PAGE电泳条带分子质量大小与理论值不符合，通过不同盐浓度下 pst-1178的15N-HSQC二维谱证明这个蛋白可能是聚合物[11]，进一步可采用动态光散射等方法来测定其分子质量并加以确证[10]。

今后，将通过解析效应蛋白的三维结构以及它们的体外、体内的蛋白互作试验，深入探索效应蛋白的调控通路，为寻找跨膜方式和阐明条锈菌侵染机制，及更有效长久地防治小麦条锈菌提供借鉴。

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