青海省马铃薯软腐病病原菌的鉴定

王 信，程 亮，蔡晓剑，王亚艺，高旭升，李松龄

(1.青海大学 农林科学院 土壤肥料研究所，西宁 810016；2.青海大学 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016；3.青海大学 农林科学院 植物保护研究所，西宁 810016)

马铃薯是青海省的主要粮食作物，是结构调整中重点发展的十大产业之一，而且成为青海省农民增收的主要产业。2013年青海省马铃薯种植面积达到9.56万hm2，总产量达到2 150万t[1]，仅次于小麦和油料，成为第三大作物，主要种植于互助、民和、乐都、湟中、大通、平安等东部各县的山区。马铃薯软腐病是青海马铃薯生产的主要病害之一，该病害初期仅在局部地区发生，随着带病种薯的频繁调运，种植面积逐年扩大，危害越来越大。因此，防治马铃薯软腐病是确保青海省马铃薯高产、稳产的重要环节，也是确保收获的块茎能够安全储藏的重要条件之一。果胶杆菌属(Pectobacterium)病原菌是造成马铃薯软腐病、茎枯萎和黑胫病以及其他寄主植物的致病菌，在作物生长、繁殖、运输和储藏期间都可造成危害，引起作物经济损失。果胶杆菌属系肠杆菌科的一员，和其他致病因子一样，分泌大量的植物细胞壁降解酶，引起植物组织浸渍和水浸症状，感染植物组织后通常表现为软腐[2-3]。果胶杆菌属依据其寄主范围、生理生化和分子特征，将其分为5个种，分别为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种[Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum(Pcc) (syn.Erwiniacarotovorumsubsp.carotovorum)],黑腐果胶杆菌[P.atrosepticum(Pa) (syn.E.carotovorumsubsp.atrosepticum)],山葵果胶杆菌[P.wasabiae(Pw) (syn.E.carotovorumsubsp.wasabiae)],软腐果胶杆菌甜菜亚种[P.betavasculorum(Pbv) (syn.E.carotovorumsubsp.betavasculorum)]和软腐果胶杆菌巴西亚种[P.carotovorumsubsp.brasiliense(Pcb)][4]。果胶杆菌属寄主范围广泛，从土壤、水体、寄主植物和节肢动物上都可以分离获得此属的菌株。其中Pa通常在温带寄主植物上存活[5]，而Pcb和Pw通常在热带和亚热带地区引起马铃薯软腐病和黑胫病[6]。目前为止，果胶杆菌属引起马铃薯软腐病在中国部分地区已有报道，然而青海地区马铃薯软腐病致病菌的致病性和分类鉴定鲜有报道。本研究从青海省的乐都县、互助县、湟中县、大通县和平安县马铃薯生产田的马铃薯软腐病的发病块茎组织中分离病原菌，通过对病原菌的形态观察、生理生化指标测定，分析马铃薯软腐病病原菌的致病性、表型特征和16S rRNA基因序列的系统发育树，明确青海省马铃薯细菌性软腐病的病原菌种类及其生物学特征和致病力差异。

1 材料与方法

1.1 病样采集及培养基

马铃薯软腐病标样采集于青海省的乐都县、互助县、湟中县、大通县和平安县的马铃薯生产田。

结晶紫果胶酸盐选择性培养基(CVP)：在500 mL沸腾的蒸馏水中按顺序加入1 mL 0.75 g/L 结晶紫溶液，4.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，3 mL 100 g/L CaCl2·2H2O溶液(新鲜溶液)，3.0 g琼脂粉，1.0 g NaNO3，9.0 g聚果胶酸钠，在聚果胶酸钠加入时人工搅拌30 s，然后分别装入三角瓶，121 ℃灭菌20 min，趁热将培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制成平板。

Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，琼脂粉15 g，用去离子水混合定容至1 000 mL，pH 7.0。然后分别装入三角瓶，121 ℃灭菌20 min，趁热将培养基倒入无菌培养皿，冷却后制成平板。

1.2 病原菌分离

采用常规组织分离法分离病原菌。称取0.1 g 病块茎置于250 mL的三角瓶中，并加入100 mL 的蒸馏水，放入玻璃珠充分打散混合液，置于120 r/min 摇床中，培养30 min后，充分摇匀。用1 mL无菌的吸管吸取10-2mL-1菌悬液1 mL放入9 mL的无菌水管中，吹吸 3次混匀即为10-3mL-1稀释液，依次从10-3mL-1连续稀释至10-7mL-1，即得一系列10倍的稀释液。每个梯度重复进行3次平行试验，分别涂布到CVP培养基上，25～27 ℃黑暗培养48 h，将形态典型的菌落在CVP培养基反复划线，进行纯化培养，挑取单菌落进行编号和保存。

1.3 致病力测定

选择健康马铃薯品种‘大西洋’的块茎用于致病性分析。将5个待测菌株于液体LB培养基中培养24 h，用无菌的9 g/L溶液洗涤3次后，配置5×108cfu/mL的菌悬液。将无病的大小均匀的块茎用自来水冲洗后放入5 g/L NaCl溶液中洗2次，每次20 min，然后用无菌去离子水冲洗1～2次，放入超净台中自然晾干，用无菌竹牙签给每个块茎打2～3个接种孔，深度约为20 mm，用9 g/L NaCl溶液配制成5×108cfu/mL的菌悬液，取10 μL加入接种孔中，每个菌株接种10个块茎。用凡士林将块茎上的接种孔封口保湿，将接种的块茎置于温度为22 ℃、相对湿度≥92%的温室培养。同等条件下，设无菌9 g/L NaCl溶液为空白对照。接种后72 h时测量病斑的直径并取其平均值作为病斑平均直径。按以下分级标准记录病斑：1～5 mm为弱致病力，5～10 mm为中等致病力，10 mm以上为强致病力。

1.4 菌株形态和生物化学特性分析

菌落形态、革兰氏染色和鞭毛染色、柠檬酸盐分解及37 ℃生长测定参照《植病研究方法》(第3版)[7]进行。病原菌对蔗糖、麦芽糖、山梨醇、阿拉伯醇、乳糖和α-甲基葡糖苷等的利用测定试验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)[8]和《植病研究方法》(第3版)[7]进行。选用青海大学农林科学院土壤肥料研究所农业微生物实验室(以后称本实验室)保存的软腐病致病菌Pa(编号:Ba11)和Pcc(编号: ECC71)为对照菌株。

1.5 16S rRNA基因片段的扩增与序列分析

1.5.1 基因组DNA的提取 将保存于-80 ℃冰箱的菌株划线，并于28 ℃培养箱中倒置培养过夜活化，挑取单菌落放入液体LB培养基中，置28 ℃培养16～18 h。病菌DNA的提取使用Ezup柱式SK8255试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。取1 μL DNA溶液用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，DNA于-20 ℃保存，备用。

1.5.2 16S rRNA片段的扩增 应用细菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′)；1942r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增。每个PCR反应体系总体积均为25 μL，包括2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL(编号为KT201-02，Tiangen)，DNA模板(50 ng/L)1 μL，引物各1 μL，双蒸水10.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。回收大小约1.5 kb的PCR产物。将其连接到pGEMT-Easy载体(Promega corp.，美国)上，转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞中。重组质粒经NotⅠ酶切和PCR鉴定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5.3 16S rRNA系统发育树构建 测序结果用软件Chromas(ver.2.4.1)进行序列修正后，在NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast检索与目标序列同源性高的DNA序列，与本文所测菌株序列分别进行比对。利用软件MEGA(ver.5.05)的UPGMA构建系统发育树，各分支的置信度自举检测(bootstrap)1 000次。

1.6 Pcc亚种特异引物扩增基因

用Pcc特异性引物EXPCCF(5′-GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA-3′)和EXPCCR(5′-GCCGTAATTGCCTACCTGCTTAAG-3′)[9]扩增5个分离菌株pECC2F序列区域。25 μL的PCR反应体系：DAN模板1 μL(100 ng/L)，2×TaqPCR Master Mix 12 μL，上游引物1 μL(20 μmol/L)，下游引物1 μL(20 μmol/L)，加ddH2O至总体积25 μL。PCR扩增条件:94 ℃变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。以2 000 bp DNA marker为分子质量标准，取4 μL PCR扩增产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，核酸染料染色观察是否有特异性条带产生。选用本实验室保存的果胶杆菌致病菌Pa(Pa11)为对照菌株。

2 结果与分析

2.1 软腐病菌的分离和致病性测定

软腐病病样中分离的菌株经CVP选择性培养基筛选，选择在CVP培养基上生长的菌株向培养基内部扩展，形成杯状凹陷(图1-A)，将分离的菌株回接到宿主马铃薯块茎上，块茎组织从接种部位开始产生水渍状病变并向接种点周围迅速扩散(图1-B)。其症状于田间采集的马铃薯软腐病样症状一致，对接种发病的马铃薯块茎组织重新分离病原菌，得到的5个菌株均能引起马铃薯块茎软腐症状。

2.2 软腐病菌的形态及生物化学特征分析

软腐病病样中分离的5个菌株经CVP选择性培养基筛选，在CVP培养基上产生凹陷的菌株。将菌株转接到LB固体培养基上，菌落形态呈圆形、乳白色、表面光滑，略隆起。革兰氏染色呈阴性。所有测试菌株均可在37 ℃生长，具有耐盐性，对红霉素不敏感，能使明胶液化，过氧化氢酶反应呈阳性，蔗糖试验还原反应、氧化酶和磷酸酶活性及吲哚产生试验均呈阴性，不能利用D-麦芽糖、山梨醇、D-阿拉伯糖醇和α-甲基葡萄糖，但可以利用柠檬酸盐、乳糖、纤维二糖、棉子糖和蜜二糖(表1)，这些结果与报道的胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum)的生物学形态特征和生理生化特性均吻合[4]。

图1 菌株在CVP培养基平板上产生杯状凹陷(A)和接种48 h后块茎症状(B)Fig.1 Cup-shaped cavities formation of isolated pathogen from diseased tuber of potato in field on CVP agar (A) and symptom of healthy tuber at 48 h after in vitro-inoculation with pathogen (B)

2.3 16S rRNA的序列分析及系统发育树构建

分离获得的5个菌株QPB-4、QLL-10、QDM-7、QHX-4和QHL-2的16S rRNA基因经PCR扩增，均得到一条大小约为1.5 kb的片段(图2)，与胡萝卜软腐病果胶杆菌16S rRNA基因的扩增片段大小近似，在NCBI数据库中将测序结果与已知序列进行BLAST比对，结果表明，5个菌株与Pcc(KR054976.1)的16S rRNA基因序列的相似度(或一致性)均达99%。基于16S rRNA基因完整序列，以马铃薯黑胫病致病菌(Dickeyasolani)菌株ND14b为外组，将5个菌株的序列与已发表的38株软腐菌菌株的序列构建系统发育树(图3)。结果显示，本研究分离得到的5个菌株与已发表的Pcc菌株形成的类群构成明显的分枝，已发表的Pcb与Pco菌株形成的类群构成独立的分枝，Pa和Pb菌株共同组成的类群与Pw菌株组成的类群也聚集成另外分枝。

2.4 Pcc特异性引物扩增

用Pcc特异性引物EXPCCF和EXPCCR扩增5个菌株及其对照菌株。结果表明5个菌株中均扩增得到一条大小约为550 bp的特异性条带(图4)；而在对照菌株Pcb(BC1)中没有得到扩增产物，由此可见，分离的5个菌株均被鉴定为Pcc。

表1 从田间病薯块茎分离的5个菌株的生理生化特征Table 1 Physiochemical characteristics of 5 strains isolated from diseased tubers of potato plants in field

注：+.阳性反应；-.阴性反应。

Note：+ and - indicate positive and negative reactions.

M.DNA marker DL2000；1.无菌水用作阴性对照 Sterile water used as negative control;2.菌株QPB-4 Strain QPB-4；3.菌株QHL-2 Strain QHL-2;4.菌株QDM-7 Strain QDM-7; 5.菌株QLL-10 Strain QLL-10;6.菌株QHX-4 Strain QHX-4

图2不同分离菌株16SrRNAPCR的琼脂糖凝胶电泳
Fig.2Ethidiumbromide-stainedagarosegelelectrophoresisshowingPCRproductsamplifiedin16SrRNAgenesofdifferentstrains

2.5 软腐病菌致病力测定

以马铃薯块茎接种病原菌产生的病斑长度作为判定细菌的致病力。块茎竹签伤口接种后72 h时统计病斑长度，发现5个菌株之间不存在明显的致病力差异，按病斑长度划分为低、中和高等致病力。Pcc亚种之间的菌株致病力不存在差异，菌株QPB-4、QHX-4、QDM-7和QLL-10在接种后72 h时表现较强致病力，而菌株QHL-2表现为中等致病力。同时来自不同地区的菌株致病力差异也不显著(表2)。

3 结论与讨论

支点上的数字为 Bootstrap 生成的百分率，条形图表示遗传距离 The number at each branch points showed percentage supported by Bootstrap,bar indicated the genetic distance of evolutionary branches

图35个菌株与其他菌株的16SrRNA基于序列构建系统发育树
Fig.3Phylogenictreebasedonblastresultsof5strainsPectobacterium16SrRNAsequence

表2 5个Pcc菌株的采集地点及致病力等级Table 2 Sampling sites and pathogencity level of 5 Pcc strain collections

注：M.致病力中等；H.高致病力。

Note： M.moderate pathogenicity;H.high pathogenicity.

M.DNA marker DL2 000；1.无菌水用作阴性对照 Sterile water used as negative control; 2.菌株QPB-4 Strain QPB-4；3.菌株QHL-2 Strain QHL-2;4.菌株Pa(Pa11) Strain Pa(Pa11); 5.菌株QLL-10 Strain QLL-10;6.菌株QHX-4 Strain QHX-4; 7.菌株QDM-7 Strain QDM-7

图4分离的5个不同菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.4Ethidiumbromide-stainedagarosegelelectrophoresisofPCRproductsamplifiedfrom5differentstraincollections

Pcc是自然条件下寄主种类众多和地理分布最为广泛的植物病原菌，能浸染温带和亚热带地区种植的马铃薯、白菜、甘蓝、胡萝卜、番茄、洋葱、芹菜和黄瓜等数百种蔬菜，以及某些花卉植物，如马蹄莲、菊花、兰花、蝴蝶兰和君子兰等[2]。马铃薯软腐病是马铃薯生产上的重要病害之一，近年由于青海不断扩大马铃薯种植规模，软腐病在青海省的发生范围也蔓延扩大。本研究通过对青海省马铃薯软腐病的病原菌分离、形态观察、致病性测定及16S rDNA基因序列比较，明确引起青海省马铃薯软腐病的病原为胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)。该亚种引发马铃薯软腐病，此后导致西椒、胡萝卜和万年青植物的软腐病，也有巴西、摩洛哥等国家马铃薯软腐病来源于该菌系[10-15]。5个菌株的形态表型特征与果胶软腐杆菌(Pectobacterium)相似。进一步测定该病原菌的生理生化特征，包括过氧化氢酶、氧化酶产生、明胶液化、蔗糖还原、磷酸酶活性、吲哚产物、对红霉素的敏感性、碳水化合物产酸、有机盐产酸、37 ℃生长及50 g/L NaCl溶液中的生长情况，与胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(Pcc)特征完全一致[4]。不同于Pa与Pw菌系低于36～37 ℃的生长特性，又有别于Pb菌系不能利用柠檬酸和明胶的特性，5个菌株与参试菌株Pall均可以在37 ℃和5 g/L NaCl培养基中正常生长，具备降解柠檬酸和明胶特征，这与Pc菌株表现一致，支持其属于Pc种的归类[16-18]。

DNA标记、血清学和DNA 杂交在许多植物病原细菌致病亚种和致病型区分方面有报道，其中16S rRNA序列分析是目前主要的细菌系统发育分类方法[19]。为了进一步明确病原菌的亚种分类地位，对测试菌株的基因组进行分析。通过对16S rRNA基因序列分析，结合Pcc亚种pECC2F序列特异性引物扩增，将分离得到的5个软腐病菌均鉴别为Pcc。16S rRNA基因完整的序列分析及系统进化树结果将分离得到的5个软腐菌与已发表的Pcc菌系共同形成明显的Pcc分支，且该分支中与Pco和Pcb归为不同类群；利用Pcc亚种pECC2F序列的特异性引物在Pcc菌系中均扩增出1条大小约550 bp的Pcc特异条带，而Pcb菌株无扩增产物。此外，EXPCC特异性引物扩增方法也可用于Pcb亚种的鉴定[20]。Onkendi等[21]报道用EXPCCF/EXPCCR特异性引物在Pcc菌系中扩增得到550 bp的特异性条带，而Pcb中无扩增产物。Nabhan等[18]研究认为16S rRNA仅能区分细菌种的差异，而不能对亚种进行区分，但本研究在5个Pcc菌株中，有2个Pcc菌株与已发表的Pcc菌系聚集成由Pcc菌株构成的亚类群，而遗传关系相对较远的Pco和Pcb菌株单独成群。可见，基于16S rRNA基因序列在一定程度上也揭示亚种之间的遗传关系。

本研究致病力鉴定结果发现5个菌株不存在明显的致病力差异，亚种内不同地区的菌株之间也不存在明显的致病力分化。据文献报道，马铃薯细菌性软腐病多为Pcc亚种所致[10，12，22-24]。但本研究在青海省其他地区马铃薯软腐病病样中也分离到Pcb和Pco，用该亚种接种马铃块茎茎亦能引起植株块茎软腐症状，但接种马铃块茎茎软腐程度不同，并且Pcb和Pco菌株占分离菌株的比例不高。因此引起青海省马铃薯软腐病的病原主要是Pcc。关于Pcc与Pcb、Pco二者或三者在青海春种马铃薯产区的分布、扩散及复合浸染有待进一步研究。

Reference：

[1] 王 舰,王 芳.2013年青海省马铃薯产业发展现状与可持续发展[C]∥中国马铃薯大会.黑龙江:大兴安岭加格达奇区,2014:162-165.

WANG J,WANG F.Development status and sustainable development of potato industry in Qinghai province in 2013[C]∥Chinese Potato Congress.Greater Khingan Mountains.Heilongjiang:Jiagedaqi District,2014:162-165.

[2] PEROMBELON M C M.Potato disease caused by soft-rotErwinias:an overview of pathogenesis [J].PlantPathology,2002,51(1):1-12.

[3] TOTH I K,BELL K S,HOLEVA M C,etal.Soft-rotErwinae:from genes to genomes [J].MolecularPlantPathology,2003,4(1):17-30.

[4] CHOI O,KIM J.Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensecausing soft rot on paprika in Korea [J].JournalofPhytopathology,2013,161(2):125-127.

[5] CZAJLOWSKI R,PROMBELON M C M,UANEEN J A,etal.Control of blackleg and tuber soft rot of potato caused byPectobacteriumandDickeyaspecies:a review [J].PlantPathology,2011,60(6):999-1013.

[6] NGADZE E,BRADY C L,COUTINHO T A,etal.Pectinolytic bacteria associated with potato soft rot and blackleg in South Africa and Zimbabwe[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2012,134(3):533-549.

[7] 方中达.植病研究方法(第3版)[M].北京：中国农业出版社,1998:12-164.

FANG ZH D.Plant Nathology Research Methods (3rd version)[M].Beijing:China Agriculture Press,1998:12-164.

[8] GARRITY G M, BELL J A, LILBURN T G.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[M].Berlin:Springer Verlag, 2004.

[9] KANG H,KWON S W,GO S J.PCR-based specific and sensitive detection ofPectobacteriumcarotovorumssp.carotovorumby primers generated from a URP-PCR fingerprinting-derived polymorphic band [J].PlantPathology,2003,52(2):127-133.

[10] FAQUIHI H,TERTA M,AMDAN M,etal.Phenotypic and genotypic diversity ofPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumcausing soft rot disease of potatoes in Morocco [J].EuropeanJournalofPlantPathology,2015,143(4):801-811.

[11] YAHIAOUI-ZAIDI R,JOUAN B,ANDRIVON D.Biochemical and molecular diversity amongErwiniaisolates from potato in Algeria [J].PlantPathology,2003,52(1):28-40.

[12] GALLELLI A,GALLI M,SIMONEDD,etal.Phenotypic and genetic variability ofPectobacteriumcarotovorumisolated from artichoke in the Selevalley[J].JournalofPlantPathology,2009,91(3):757-761.

[13] MAISURIA V B,NERURKARA S.Characterization and differentiation of soft rot causingPectobacteriumcarotovorumof Indian origin [J].EuropeanJournalofPlantPathology,2013,136(1):87-102.

[14] MA B,HIBBING M E,KIM H S,etal.Host range and molecular phylogenies of the soft rot enterobacterial generaPectobacteriumandDickeya[J].Phytopathology,2007,97(9):1150-1163.

[15] DUARTE V,BOERS H D,WARD L J,etal.Characterization of atypicalErwiniacarotovorastrains causing blackleg of potato in Brazil [J].JournalofAppliedMicrobiology,2004,96(3):535-545.

[16] GARDAN L,GOUY C,CHRISTEN R,etal.Elevation of three subspecies ofPectobacteriumcarotouorumto species level:Pectobacteriumatrosepticumsp nov,Pectobacteriumbetavasculorumsp nov andPectobacteriumwasabiaesp nov[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2003,53(2):381-391.

[17] GALLOIS A,SAMSON R,AGERON E,etal.Erwiniacarotovorasubsp.odoriferasubsp.nov.,associated with odorous soft rot of chicory(CichoriumintybusL.)[J].InternationalJournalofSystematic&EvolutionaryMicrobiology,1992,42(4):582-588.

[18] NABHAN S,BOER S H D,MAISSE,etal.Taxonomic relatedness betweenPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum,Pectobacteriumcarotovorumsubsp.odoriferumandPectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensesubsp.nov[J].JournalofAppliedMicrobiology,2012,113(4):904-913.

[19] MAHMOUDI E,SOLEIMANI M J,TAGHAVI M.Detection of bacterial soft-rot of crown imperial caused byPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumusing specific PCR primers[J].PhytopathologiaMediterranea,2007,46(2):168-176.

[20] NABHAN S,WYDRA K,LINDE M,etal.The use of two complementary DNA assays,AFLP and MLSA,for epidemic and phylogenetic studies of petolytic enterobacterial strains with focus on the heterogeneous speciesPectobacteriumcarotovorum[J].PlantPathology,2012,61(3):498-508.

[21] ONKENDI E M,MOLELEKI L N.Characterization ofPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumandbrasiliensefrom diseased potatoes in Kenya[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2014,139(3):557-566.

[22] PITMAN A R,WRIGHT P J,GALBRAITH M D,etal.Biochemical and genetic diversity of pectolytic enterobacteria causing soft rot disease of potatoes in New Zealand[J].AustralasianPlantPathology,2008,37(6):559-568.

[23] SEO S T,FURUYA N,LIM C K,etal.Phenotypic and genetic diversity ofErwiniacarotovorassp.carotovorastrains from Asia[J].JournalofPhytopathology,2002,150(3):120-127.

[24] TERTA M,EI KARKOURI A,AIT MHANDR,etal.Occurrence ofPectobacteriumcarotovorumstrains isolated from potato soft rot in Morocco[J].CellularandMolecularBiology,2010,56:1324-1333.