响应面法优化益生菌发酵青稞饮料工艺

易晓成,万 萍*,白 娜

(1.四川工商职业技术学院 酒类与食品工程系,四川 都江堰 611830；2.成都大学药学与生物工程学院,四川 成都 610106)

青稞是禾本科大麦属的一种作物,主要分布在我国的青藏高寒地区[1]。青稞除含有丰富的碳水化合物、蛋白质和人体必需氨基酸外,还含有多种维生素,铜、锌、锰等20余种矿物元素[2-3],是谷类作物中的佳品。它不仅是藏族人民重要的粮食,还具有其独到的药效,如除湿、止泻等,可用于治疗相关的疾病[4-5]。同时,由于青稞具有较高含量的β-葡聚糖,对降胆固醇、降血糖贡献巨大[6-7]。因此,也成为食品加工的一个新的研究方向。

益生菌能促进宿主肠道菌群的生态平衡[8],其发酵所产生的乳酸是一种天然的防腐保鲜剂,可保持活性益生菌的稳定性、安全性,并能赋予产品酸爽的口感；同时,益生菌发酵所产生的乳酸菌素能有效地抑制病原菌和腐败菌；另外,益生菌发酵过程中产生的种种生物活性物质具有降低胆固醇、降血糖、改善肝功能、提高免疫力等多重保健功能,对身体健康发挥着积极的作用[9-10]。目前青稞除用作口粮、焙烤食品和酿酒的原料外,青稞发酵饮料鲜有报道,国内仅马长中等[11]采用单一乳酸菌LAB005证明了乳酸菌发酵青稞饮料是可行的,而采用益生菌(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)发酵青稞饮料的研究国内外尚鲜见报道。

以青稞为原料,利用酶工程技术得到含有适量碳源和氮源的青稞酶解液[12]。本研究以该青稞酶解液为原料,研究不同的发酵时间、发酵起始pH、发酵温度、益生菌接种量等因素对发酵的影响；并以发酵酸度为响应值,采用响应面法对益生菌发酵青稞饮料的发酵工艺进行优化,以期为青稞饮料的研发提供参考,对青稞的有效开发及产业的发展起到积极的推动作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青稞:市售；直投式益生菌发酵剂(保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)):北京川秀科技有限公司；碳酸钠(分析纯):成都市科龙化工试剂厂；青稞酶解液:本实验室提供。

1.2 仪器与设备

GNP-9270型恒温培养箱:上海齐欣科技有限公司；LD型电子天平:沈阳龙腾电子有限公司；pHS-3C型酸度计:成都世纪方舟科技有限公司；SW-CJ-2D型无菌操作台:苏州净化设备有限公司；HH型恒温水浴锅:金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 益生菌发酵青稞饮料工艺流程

1.3.2 操作要点

接种:将试验所需的器材在0.1MPa(121～126℃)条件下灭菌15min；取青稞酶解液,用10%的碳酸钠溶液调节pH,每组分装50 mL后在沸水浴中杀菌10 min,冷却至40℃左右,在无菌操作台上接种直投式益生菌发酵剂,振荡均匀。

恒温发酵:按照单因素试验设计的方案,将接种后的青稞酶解液置于恒温培养箱中,发酵一定时间后,测定发酵液的酸度。

调配:按照本实验室研究得出的工艺配方,加入蔗糖进行调味,并加入复配稳定剂得到成品[13]。

1.3.3 试验设计

(1)单因素试验设计

试验选取发酵时间(8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64 h、72 h、80 h、88 h)、发酵起始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、接种量(3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%)、发酵温度(36℃、38℃、40℃、42℃、44℃)等因素分别进行试验,以探讨其对发酵液酸度的影响。

(2)响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上,根据中心组合试验设计(centralcomposite design,CCD)原理,以发酵液酸度为响应值,使用Design-Expert8.0.5软件,选取发酵温度(A)、发酵起始pH值(B)及接种量(C)为自变量,采用3因素3水平的响应面法对试验结果进行优化,以确定最佳的发酵工艺条件[14-15]。试验因素与水平见表1。

表1 饮料发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for beverage fermentation technology optimization

1.3.4 检测方法

酸度的测定:电位滴定法[16]；pH值的测定:酸度计法[17]；还原糖含量的测定:直接滴定法[18]；氨基酸含量的测定:甲醛滴定法[18]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间的确定

发酵时间的长短直接影响益生菌发酵生成乳酸的量以及发酵的完全程度。在发酵起始pH 7.0,接种量4.5%,发酵温度40℃的条件下,探讨了不同发酵时间对发酵液酸度的影响,其结果见图1。

图1 发酵时间对发酵液酸度的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the acidity of fermentation broth

由图1可知,发酵液的酸度随着发酵时间的增加而增大,当达到72 h后,虽然酸度有所增加,但增幅不大,基本趋于稳定,故确定最适发酵时间为72 h,此时发酵液的酸度达到64.6°T。

2.1.2 发酵起始pH的确定

益生菌的生长需要特定的pH来维系细胞内各种生物活性分子的结构稳定,同时胞内酶也需要一个最适的pH值来维持其活性[19]。益生菌生长pH范围一般为5.0～7.5,且随着发酵的进行,pH值不断降低,将对益生菌的生长更加不利[20],因此需要确定一个起始pH使益生菌更好地生长和发酵。在接种量4.5%,发酵温度40℃,发酵时间72 h的条件下,探讨了不同发酵起始pH对发酵液酸度的影响,其结果见图2。

图2 发酵起始pH对发酵液酸度的影响Fig.2 Effect of initial pH on acidity of fermentation broth

由图2可知,在其他发酵条件一定的情况下,起始pH在6.0～7.0时发酵液的酸度随着起始pH值的增加而呈现上升趋势,当起始pH在7.0～8.0时发酵液的酸度随着起始pH值的增加而减小,在起始pH值为7.0时发酵液酸度达到最大(65.0°T)。当环境偏酸或偏碱,使益生菌内酶的活力降低,生长能力变弱,产酸的能力也就变弱[20],因此确定pH值7.0为益生菌生长的最适发酵起始pH。

2.1.3 接种量的确定

接种量大小不仅直接影响到益生菌发酵青稞饮料的发酵速率,而且对最终产品的风味也会产生决定性的影响[21]。在发酵起始pH 7.0,发酵温度40℃,发酵时间72 h的条件下,探讨了不同接种量对益生菌发酵液酸度的影响,其结果见图3。

图3 接种量对发酵液酸度的影响Fig.3 Effect of inoculum on acidity of fermentation broth

由图3可知,在其他发酵条件一定的情况下,当接种量在3.5%～4.5%时,发酵液酸度随着接种量的增大而增大,当接种量在4.5%～5.0%时,发酵液酸度随着接种量的增大而减小,接种量继续增加到5.5%时,发酵液酸度不再变化,在接种量为4.5%时发酵液酸度达到最大值(63.0°T)。此时底物浓度与益生菌的比例达到最佳,发酵酸度达到最大；当接种量低于或高于4.5%时,均会影响乳酸的生成。因此确定4.5%为最适接种量。

2.1.4 发酵温度的确定

发酵温度影响到益生菌的生长进而影响发酵的速度和乳酸的积累。在发酵起始pH7.0,接种量4.5%,发酵时间72 h的条件下,探讨了不同发酵温度对益生菌发酵液酸度的影响,其结果见图4。

图4 发酵温度对发酵液酸度影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the acidity of fermentation broth

由图4可知,在其他发酵条件一定的情况下,发酵温度在36～40℃时,发酵液的酸度随着发酵温度的升高而增大,当发酵温度在40～44℃时,发酵液的酸度随着发酵温度的升高反而减小,当发酵温度为40℃时,酸度达到最大(66.0°T)。发酵温度过低或过高均会抑制益生菌的生长,从而产酸能力降低,产酸量也就小。因此确定40℃为最适发酵温度。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面方案设计与结果

根据中心组合试验设计(centralcompositedesign,CCD)原理,综合单因素试验结果,使用Design-Expert8.0.5软件,选取发酵温度(A)、发酵起始pH值(B)、接种量(C)为自变量,以发酵液酸度(Y)为响应值,设计了3因素3水平的响应面试验组,响应面试验结果见表2,方差分析见表3。

表2 饮料发酵工艺优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for beverage fermentation technology optimization

用Design-Expert 8.0.5软件对试验数据进行多元回归拟合,得到试验因素对酸度的回归方程如下:

由表3可知,该模型的F值87.65,P＜0.000 1,回归模型极其显著；A、B、C、A2、B2、C2对酸度影响极显著(P＜0.01),AB、AC、BC对产酸的交互效应影响分别是极显著(P＜0.01)、显著(P＜0.05)和不显著(P＞0.05)。失拟项P=0.1238＞0.05不显著,说明该模型与纯误差关联不显著,该方案可用于实际生产。根据表3拟合回归方程的复相关系数R2为0.987 5,说明该模型拟合程度很好,误差小,试验条件的选择适宜。

2.2.2 响应面结果分析及最佳工艺验证

采用Design-Expert8.0.5软件获得三维响应面和等高线图,能够直观地反映出各因素及其相互作用对试验结果的影响,结果见图5。

由图5a可知,发酵温度(A)对酸度的影响要大于接种量(C)对酸度的影响；等高线图中椭圆度较大,说明AC两因素之间交互影响显著(P＜0.05)；由图5b可知,发酵起始pH值(B)对酸度的影响比发酵温度(A)更明显(P＜0.01)；等高线图中椭圆度很大,说明AB两因素之间交互影响极显著；由图5c可知,发酵起始pH值(B)比接种量(C)的对酸度的影响大；等高线图的椭圆度的较小,说明BC两因素之间交互作用不显著(P＞0.05)。

经Design-Expert8.0.5软件优化处理后,得到益生菌发酵青稞发酵饮料的最佳工艺条件为:发酵温度41.05℃,发酵起始pH值7.25,接种量4.69%。将响应面优化方案修约后的工艺条件进行3组平行试验即:在发酵起始pH值7.3,接种量4.7%,发酵温度41℃,发酵时间72 h,3个试验组发酵液酸度的平均值可以达到68.67°T,与理论预测值69.21°T的相对误差为0.79%,与试验结果相符。

图5 发酵温度、接种量和发酵起始pH交互作用对发酵液酸度影响的响应面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,inoculum and fermentation initial pH on the acidity of fermentation broth

3 结论

本研究以青稞酶解液为原料,采用响应面法对益生菌发酵青稞饮料的工艺条件进行了优化,结果表明,3个因素对产酸的影响顺序为发酵起始pH值＞发酵温度＞接种量；3个因素两两间的交互作用对产酸的影响分别是:发酵温度与发酵起始pH值极显著(P＜0.01),发酵温度与接种量显著(P＜0.05),发酵起始pH与接种量不显著(P＞0.05)。益生菌发酵青稞饮料的最佳工艺条件为:发酵起始pH值7.3,直投式益生菌发酵剂(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)接种量4.7%,发酵温度41℃,发酵时间72 h,发酵液的酸度可达到68.67°T。发酵液经加入蔗糖和复配稳定剂调制后,得到颜色呈乳白色,性状稳定,口感宜人,且含有活菌的益生菌发酵青稞饮料,是一款营养丰富、品质优良的保健饮料。

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