郫县豆瓣加工过程中黄曲霉毒素B1的变化及关键控制点研究

张 帅,马秀灵,李 恒,4,陈 功,4,杨国华,李洁芝,李 峰,黄 静,张其圣,4*,游敬刚,陈相杰

(1.四川省食品发酵工业研究设计院,四川 温江 611130；2.成都中医药大学,四川 温江 611137；3.四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司,四川 成都 611732；4.四川东坡中国泡菜产业技术研究院,四川 眉山 620000)

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉在生长过程中的一类次级代谢产物[1-2],已被世界卫生组织列为最强化学致癌物质之一[3-4]。目前,已分离鉴别出的黄曲霉毒素共有20多种,其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是毒性最强且致癌性最大的一种。近年来,随着我国食品行业的不断创新与发展,豆瓣产业也随之呈现稳固上升的趋势,然而开放式的豆瓣制作环境[5-6]和复杂繁长的制作工序也使得豆瓣在生产加工过程中存在某些食品安全隐患。过去的研究表明,AFB1是豆瓣加工过程中最主要的问题之一。

由于豆瓣生产中所用米曲霉与黄曲霉的生长条件相近,生产控制不严很容易造成杂菌污染并产生黄曲霉毒素[7]。同时,还有很多关于豆瓣加工过程中黄曲霉毒素污染的原因及其控制的研究[8]。在制曲过程中,徐坤等[7]利用响应面法优化得到豆瓣的最佳制曲工艺,并控制了豆瓣酱中AFB1的含量。在辣椒醅发酵过程中,徐洲等[9]通过对辣椒原料中AFB1含量的测定及防控措施进行了探讨,得出辣椒醅是导致豆瓣产生AFB1的原因及辣椒醅中优势菌群为乳酸菌的结论。徐进等[10]利用乳酸菌能影响黄曲霉的生长及产毒,使得生物学脱毒法在降低豆瓣中AFB1的含量方面得到了应用。在豆瓣发酵过程中,汪先丁等[11]研究了郫县豆瓣在自然发酵过程中真菌群落的演替与黄曲霉毒素B1消长的关系。此外,关统伟等[12]探讨了郫县豆瓣在不同发酵期细菌群落结构及其动态的演替,赵红宇等[13-14]对豆瓣后发酵期细菌多样性和真菌演替变化的研究,刘春凤等[15]对成熟期豆瓣酱醅中的微生物群落分析都为豆瓣发酵过程中AFB1消长的原因提供了依据。然而,国内外基于生产过程来系统研究发酵过程中黄曲霉毒素B1的变化还少有报道。因此,本实验基于郫县豆瓣的加工过程,对其各个关键工艺点进行AFB1的测定,同时按照豆瓣的制作工艺,在实验室模拟工厂的生产流程制作豆瓣,并进行AFB1含量的测定,以期为豆瓣制作过程中控制黄曲霉毒素的产生和建立关键控制点提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

制曲期、辣椒醅发酵期、豆瓣成熟期和后熟期各时间段样本:采集于郫县丹丹豆瓣厂；甲醇(分析纯):成都市科龙化工试剂厂；黄曲霉毒素B1酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒:北京华安麦科生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ST-360酶标仪:上海科华实验系统有限公司；TDL-40B低速台式离心机:上海安亭科学仪器厂；THZ-C-1全温振荡器:苏州培英实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 郫县豆瓣生产工艺流程及操作要点

(1)干蚕豆瓣在沸水中漂烫3～5 min后冷却至室温,加入25%的面粉和0.05%的曲种拌匀(以混合干料计)；30℃条件下制曲48h,32%盐水拌曲,保温发酵6～8月得到甜瓣子。

(2)新鲜辣椒剁碎,加15%盐水盐渍,发酵6个月得到辣椒醅。

(3)65%辣椒醅和35%甜瓣子配兑混合(g∶g),适当补盐,通过“翻、晒、露”6个月得到成熟郫县豆瓣。

1.3.2 AFB1测定方法

按照GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》方法进行测定[16]。

2 结果与分析

2.1 制曲过程中AFB1含量的变化

制曲作为豆瓣加工过程中的首要环节,探究该阶段AFB1的变化对于控制其在豆瓣中的含量十分重要。通过随机选取豆瓣厂中两个制曲曲房,从制曲起到制曲结束共48 h进行动态跟踪取样,每次两个平行,得到AFB1在该阶段的含量及变化趋势。测定结果如图1所示。

图1 制曲过程中黄曲霉毒素B1含量的变化Fig.1 Change of aflatoxin B1content during koji making

由图1可知,制曲过程中AFB1含量总体偏低,保持在0～0.25 μg/kg范围内,这与汪先丁等[11]所报道自然发酵条件下豆瓣酱制曲阶段的AFB1含量为2.097 μg/kg存在差异,其原因或与近年来大多豆瓣厂改用纯种发酵有关。同时,AFB1含量在制曲前期最少,表现在制曲时间为0～40 h时AFB1基本无法检出；在40 h后至出曲阶段AFB1的含量有所升高,但整体幅度不大。因此可认为制曲阶段对于豆瓣中AFB1含量的影响不大,不是郫县豆瓣加工过程中形成AFB1的关键控制点。

2.2 甜瓣子发酵过程中AFB1含量的变化

通过记录工厂内所有曲池里甜瓣子的发酵时间,再以发酵时间由短至长进行排序,每个时间段选出至少两个曲池进行取样,以探求甜瓣子发酵对豆瓣加工过程中AFB1含量变化的影响,测定结果如图2所示。

图2 甜瓣子发酵不同时期黄曲霉毒素B1含量的变化Fig.2 Change of aflatoxin B1content during different periods of sweet bean fermentation

由图2可知,在发酵1～8个月内甜瓣子的AFB1含量呈明显上升趋势,即从发酵1个月时的0.18 μg/kg增加至发酵8个月时的1.09 μg/kg。同时,图2中各时间点对应的AFB1值未呈现线性变化的原因可能是由于本试验的取样并不是基于动态跟踪,而是根据生产线的实际情况来选取的,但试验结果呈现一定的规律性则表明工厂加工豆瓣酱的工艺是较为稳定的,且造成甜瓣子在发酵过程中AFB1含量上升的原因比较固定。综上可知甜瓣子的发酵时间是郫县豆瓣加工过程中形成AFB1的关键控制点之一。

2.3 辣椒醅发酵过程中AFB1含量的变化

由于受豆瓣加工工艺的限制,对辣椒醅发酵过程中AFB1含量变化只能通过刚剁碎的辣椒与发酵成熟的辣椒醅(6个月)来进行研究。样品测定结果如图3所示。

图3 辣椒醅发酵不同时期黄曲霉毒素B1含量的变化Fig.3 Change of aflatoxin B1content during different periods of pepper grains fermentation

由图3可知,辣椒醅在发酵0月到6月的AFB1含量有所降低,从1.25μg/kg减至0.80μg/kg。由于大部分的AFB1是由黄曲霉代谢产生的,表明在辣椒醅发酵过程中黄曲霉的生长受到部分抑制,因此适当延长辣椒醅的发酵时间有助于减少豆瓣中的AFB1含量。同时也可推知在辣椒醅发酵阶段的AFB1污染主要来源于原料。表明辣醅发酵时间和辣椒原料是控制郫县豆瓣中AFB1含量的关键点。

2.4 豆瓣后熟期AFB1含量的变化

在豆瓣发酵后熟期,通过选取发酵时间为1、2、3、4、5和6个月时间段的豆瓣酱,来研究不同豆瓣酱发酵时间对其AFB1含量的影响。每个时间段取两个曲池样本,测定结果如图4所示。

图4 豆瓣酱后熟期黄曲霉毒素B1含量的变化Fig.4 Change of aflatoxin B1content during post-ripening period of bean paste

由图4可知,豆瓣酱AFB1含量在其发酵过程中呈动态变化趋势,总体含量为0.90～2.63 μg/kg,低于国家对发酵调味品的最新限量标准(5 μg/kg)[17]。在发酵时间为1～3月时,豆瓣酱中AFB1含量呈上升趋势；3～6月时,AFB1含量有所下降,且在发酵4个月后保持稳定。表明豆瓣酱在发酵一定的年份后,其AFB1含量整体趋于稳定且总体低于国家限量标准,但该阶段与成熟甜瓣子和辣椒醅中的AFB1含量相比,其AFB1含量上升明显,究其原因可能是由于豆瓣酱加工工艺中的“翻、晒、露”过程导致空气中杂菌混入豆瓣酱的发酵过程中。因此豆瓣酱的发酵时间和发酵环境是控制郫县豆瓣中AFB1含量的关键点。

2.5 豆瓣加工过程中的关键控制点研究

为了进一步明确豆瓣加工过程中影响AFB1含量的关键点,在实验室模拟工厂的豆瓣加工工艺,并依次选取豆瓣制作过程中的成曲、成熟甜瓣子(该阶段发酵6个月)、成熟辣椒醅(该阶段发酵6个月)和成品豆瓣酱(该阶段发酵3个月)四个不同阶段的样本进行AFB1含量测定,旨在探究整个豆瓣酱制作过程中控制AFB1含量的主要环节。

图5 豆瓣酱发酵过程中黄曲霉毒素B1含量的变化Fig.5 Change of aflatoxin B1content during different periods of bean paste

由图5可知,在实验室拟制作的豆瓣制曲阶段AFB1含量较豆瓣其他加工过程的含量低,表明原料中蚕豆与面粉不是豆瓣酱中AFB1产生的主要因素；在制曲后期积累AFB1,可能是由于第二次翻曲后与空气中杂菌接触,导致污染并产生AFB1。在甜瓣子发酵阶段,AFB1含量较制曲阶段略微上升。由于甜瓣子是采用保温密封发酵,一般不会与外界环境接触,因此在其发酵期受杂菌污染的机率较低,AFB1的积累可能是由于制曲阶段的杂菌引入所致。辣椒醅在整个发酵过程中其AFB1变化呈平稳上升趋势,受AFB1污染的主要原因可能部分是由原料的带入,但由于AFB1含量整体较低,结合相关文献可知这与辣椒醅中的优势菌群乳酸菌对AFB1具有分解作用有关[18]。在混合发酵至成品后,豆瓣酱中AFB1含量显著上升,原因可能是由于成熟辣椒醅和甜瓣子的引入,也可能由于豆瓣酱后熟期是需要每日进行翻晒的,相较于甜瓣子与辣椒醅的密封发酵,该阶段与空气接触的机会更多,因此就更容易被空气中的杂菌污染。综上所述,可以看出豆瓣酱的“翻晒露”阶段导致豆瓣酱中AFB1的含量大幅增加。

3 结论

本研究基于加工传统郫县豆瓣的各关键工艺流程,包括制曲阶段,甜瓣子发酵阶段,辣椒醅发酵阶段和豆瓣酱后熟阶段,在实验室对豆瓣酱进行拟制作,以此研究各工艺点的AFB1含量变化情况并得到关键控制点。结果表明,豆瓣加工过程中AFB1始终低于发酵调味品的国家最新限量标准(5 μg/kg),且含量随着豆瓣酱的成熟总体保持上升趋势。虽然在制曲环节时AFB1含量最低,但从甜瓣子发酵阶段可以看出,制曲阶段AFB1的累积效应是非常明显的,所以应该继续采用人工制曲,并且应该在制曲环节严加控制,防止AFB1从制曲阶段开始累积。同时,从辣椒醅的AFB1含量变化可以看出造成辣椒醅中AFB1污染的主要原因是原料引入,所以应对原料辣椒醅的来源和其储存环境严加把关,并对变质的辣椒及时清除。此外,在豆瓣酱发酵过程中,AFB1含量与其他加工环节相比呈现大幅上升趋势,表明在“翻晒露”环节的豆瓣酱后熟期是影响AFB1产生的关键阶段。而且由于这个阶段翻晒频繁(每日一次),导致豆瓣酱与空气接触更多从而使得其易被杂菌污染,所以豆瓣“翻晒露”阶段的环境条件十分关键。虽然豆瓣酱中AFB1的总体含量低于国家限量标准,但为了使人们尽量避免受到食品中诸如黄曲霉毒素B1等真菌毒素的威胁,应着力改善相关的生产环境,特别应加强在生产环境中对空气中杂菌的隔离,以此使得我国传统食品的安全问题真正得到有效改善。

[1]宫春波,姜连芳,张永翠,等.黄曲霉毒素在食品中的危害及去除方法[J].食品研究与开发,2004,25(1):120-123.

[2]吴兆蕃.黄曲霉毒素的研究进展[J].甘肃科技,2010,25(18):89-93.

[3]劳文艳,林素珍.黄曲霉毒素对食品的污染及危害[J].北京联合大学学报,2011,25(1):64-69.

[4]靳学敏.郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1在线监测技术[D].成都:西华大学,2011.

[5]徐 丹.酿造酱油中黄曲霉毒素B1的产生及其控制研究[D].无锡:江南大学,2012.

[6]王晓伟,高鹏飞,姚国强.乳酸菌对乳制品中黄曲霉毒素的生物防治作用[J].中国乳品工业,2015,43(3):42-49.

[7]徐 坤,王 涛.响应面法优化混合发酵法控制郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1含量的最佳制曲条件研究[J].中国酿造,2009,28(11):28-31.

[8]靳学敏,车振明.浅谈豆瓣生产过程中的安全控制[J].中国食品工业,2010(1):62-63.

[9]徐 洲,谭书明,焦彦朝.酶联免疫法测定干辣椒中的黄曲霉毒素B1[J].食品科学,2009,30(10):245-247.

[10]徐 进,李玉伟,计 融.乳杆菌及不同pH值对黄曲霉生长与产毒的影响[J].中国食品卫生,2001,13(6):1-6.

[11]汪先丁,刘 敏,高 鹏,等.郫县豆瓣自然发酵过程中真菌菌落的演替及黄曲霉毒素B1的消长[J].食品科学,2012,33(11):142-146.

[12]关统伟,向慧平,王鹏昊,等.基于高通量测序的郫县豆瓣不同发酵期细菌群落结构及其动态演替[J].食品科学,2017,38(4):1-12.

[13]赵红宇,徐炜桢,杨国华,等.基于高通量测序的郫县豆瓣后发酵期细菌多样性研究[J].食品科学,2017,38(10):117-122.

[14]赵红宇,徐炜桢,杨国华,等.基于高通量测序的郫县豆瓣后发酵期真菌演替变化研究[J].食品科学,2017,38(16):51-56.

[15]刘春凤,刘金霞,蒋立胜,等.传统发酵成熟期酱醅中的微生物群落分析[J].食品工业科技,2012,33(13):122-126.

[16]中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.22—2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定[S].北京:中国标准出版社,2016.

[17]中华人民共和国卫生部.GB/T 2761—2017食品安全国家标准食品中真菌毒素限量[S].北京:中国标准出版社,2017.

[18]刘永琪.豆瓣酱发酵的研究[D].广州:华南理工大学,2014.