GUCY1A3基因位点rs7692387单核苷酸多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病的相关性研究

周爽，尤昕

（延边大学附属医院检验科，吉林 延吉 133000）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CAD）（简称冠心病）是1种全球范围内常见的慢性病，已经成为导致人类死亡的最主要病因之一。冠心病的发病机制复杂，目前普遍认为受环境和遗传两大因素的共同影响，随着分子遗传生物学的迅速发展，对其遗传因素方面的研究也越来越受到重视[1]。自人类基因组计划实施以来，人们对冠心病有更加深入了解，文献表明，遗传因素在冠心病发病过程中的贡献高达50%[2]。近年来，全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）被广泛应用于复杂多基因疾病的研究之中，以单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）为基础的全基因组关联分析已成为研究冠心病遗传易感性的主流方法，通过该方法研究发现的冠心病相关基因位点已达50多个[3]。GUCY1A3基因位于4号染色体q32.1，长77353 bp，含有13个外显子，编码690个氨基酸，这些氨基酸组成可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）的(α1亚基。GUCY1A3基因已被认为在CAD的高遗传风险中发挥着重要作用[4]。可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）作为1种信号转导酶广泛分布于人体中，并介导心血管系统的许多生理过程，例如促进血管平滑肌舒张，抑制血小板聚集和血管重构等，因此sGC成为维持心血管稳态的关键酶[5]。该试验选取GUCY1A3基因位点rs7692387进行研究，分析其单核苷酸多态性与延边地区汉族人群CAD遗传易感性之间的关系，为开展针对性的人群预防提供新线索，同时也为延缓或防止CAD的发生提供更多的理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取延边大学附属医院心血管内科住院且相互之间无血缘关系的汉族冠心病患者204例，均符合世界卫生组织制定的缺血性心脏病的诊断标准，且经冠状动脉造影检查证实至少1支冠脉狭窄≥50%。对照组201例选自延边大学附属医院健康体检科体检结果正常，且通过询问病史、辅助检查等明确排除心血管疾病的健康人。通过查阅病案资料、问卷访谈等形式收集研究对象的基本资料及既往病史等，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 试剂

DNA提取试剂盒（美国Promega公司），SNaPshot试剂盒：ABI PRISM SNa Pshot Multiplex Kit（美国ABI公司），Taq酶：KAPA Taq Hot Start DNA Polymerase（Kapabiosystems公司），SAP 酶（Fermentas公司）、ExoI酶和CIP酶（NEB公司），琼脂糖（美国Invitrogen公司）。

1.3 仪器与设备

Beckman Allgre 21R高速冷冻离心机（Beckman公司），BC-subMIDI电泳仪（北京六一仪器厂），JY300 C电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司），Bio Sens SC 810B凝胶成像仪（上海山富科学仪器有限公司），PTC-100PCR仪（MJ公司），ABI 9700扩增仪（ABI公司），3730XL测序仪（美国ABI公司）。

1.4 试验方法

研究对象的GUCY1A3基因位点rs7692387的基因型及等位基因的检测过程主要包括设计合成引物、提取DNA、预扩增、预扩增产物纯化、延伸反应、延伸产物纯化、上机检测及整理分析数据。根据Genbank获得的GUCY1A3基因所在序列的信息，应用Primer 5.0软件设计rs7692387位点的特异性引物。正向引物：5'-CACTTCACTGTGGAAAC（C/T）GAG-3'，反向引物：5'-GTGCCTACAATGATGCCTGG-3'。入选的研究对象均在清晨空腹状态下采集外周静脉血2 ml于抗凝管中，室温摇匀后置-20℃冰箱冷冻保存备用，采用DNA提取试剂盒按使用说明书提取并纯化DNA。以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增含有目的位点的基因片段。PCR反应体系包含提取 DNA（10～20 ng/μl）2 μl，2.5×BufferⅣ 4.0 μl，Taq（5 u/L）0.15 μl，引物（5 μmol，F+R）1.5 μl，加去离子水至10 μl。PCR扩增条件为95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35个循环，72℃终末延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳质检。将所得产物用ExoI酶消化后纯化再加入延伸体系，延伸体系包括消化后预扩增产物1.2 μl，Primers Mix 2 μl，ABI Mix 0.5 μl，10×Buffer I 0.4 μl，加去离子水至5 μl。将所得延伸产物纯化后加入3730XL测序仪，采用美国ABI公司开发的Sna Pshot技术进行检测，该技术是基于荧光标记单碱基延伸原理的1种分型技术。最后应用分析软件将检测所得的原始数据文件进行整理分析。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。两组研究对象的基因型分布采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验其是否具有群体代表性。等位基因频率及基因型频率分布差异情况采用χ2检验进行分析。应用Logistic回归分析校正混杂因素对冠心病的影响，并计算值和95%可信区间（95%CI），以检测GUCY1A3基因位点rs7692387单核苷酸多态性和冠心病的相关性，以双侧P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般临床资料比较

冠心病组和对照组在性别、年龄、BMI、收缩压、舒张压、糖尿病史、TC及TG方面比较差异无统计学意义（P ＜0.05），研究对象平均年龄符合冠心病的高发年龄。冠心病组高血压、吸烟史及LDL-C均高于对照组，HDL-C低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表 1。

表1 两组的临床资料比较

2.2 基因测序结果

研究对象的GUCY1A3基因位点rs7692387共有3种基因型（见图1）：纯合子GG、AA，杂合子GA，纯合子基因型显示的峰型是单峰，杂合子基因型显示的峰型是套峰。延伸体系中包含4种荧光标记的ddNTP，分别用蓝色、黑色、绿色、红色代表延伸加入ddGTP、ddCTP、ddATP及ddTTP的延伸产物，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。

2.3 两组GUCY1A3基因位点rs7692387单核苷酸多态性与冠心病的关系

两组分别进行Hardy-Weinberg平衡检验，两组研究对象GUCY1A3基因位点rs7692387基因型频率的观察值与理论预测值比较差异无统计学意义（P ＜0.05），表明该研究的人群符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。GUCY1A3基因位点rs7692387 G/A多态性检测结果显示，冠心病组GG基因型频率高于对照组，而对照组GA+AA基因型频率高于冠心病组，差异有统计学意义（P ＜0.05），G和A 2等位基因频率分布差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

2.4 GUCY1A3基因位点rs7692387的基因型与冠心病患病风险评估

将研究对象作为整体进行分析，以GUCY1A3基因位点rs7692387的基因型（GG=1，GA+AA=2）、年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟史、收缩压、舒张压作为自变量，有无冠心病（有=1，无=0）作为因变量建立Logistic回归模型。结果显示，排除可能与冠心病有关的一些混杂因素后，GUCY1A3基因位点rs7692387的GG基因型与GA+AA基因型比较，其可增加冠心病的患病风险2.327，P=0.039），表明GG基因型可能是冠心病发病的易感基因型。见表3。

图1 GUCY1A3基因位点rs7692387的基因型测序结果

表2 GUCY1A3基因位点rs7692387基因型频率及等位基因频率分布比较

表3 GUCY1A3基因位点rs7692387的基因型与冠心病的Logistic回归分析

2.5 GUCY1A3基因位点rs7692387的等位基因与冠心病患病风险评估

将研究对象作为整体进行分析，以GUCY1A3基因位点rs7692387 的等位基因（A=1，G=2）、年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟史、收缩压、舒张压作为自变量，有无冠心病（有=1，无=0）作为因变量建立Logistic回归模型。结果显示，排除可能与冠心病有关的一些混杂因素后，GUCY1A3基因位点rs7692387的A等位基因与G等位基因比较，其可降低冠心病的患病风险表明A等位基因可能是冠心病的保护性基因。见表4。

表4 GUCY1A3基因位点rs7692387的等位基因与冠心病的Logistic回归分析

3 讨论

冠心病是严重影响人类健康和生活质量的心血管疾病之一，其发病率和死亡率逐年上升，如今已成为我国城乡居民疾病死亡的首要原因[6]。冠心病是1种多基因疾病，遗传因素对其发生和发展有影响，该基因的多态性和冠心病之间的关系是目前研究的主要方向。基因多态性反映基因的选择性表达，是人类基因组在抵御不良环境影响过程中的1种适应性表现，包括SNP、DNA重复序列多态性以及DNA片段长度多态性，在疾病易感性和人体对疾病的抵抗力等方面发挥重要作用[7]。SNP是基因多态性中最常见的1种，已被列为对复杂性疾病产生影响的最主要因素之一[8]。已有研究证实，单个或多个基因的遗传易感性会对CAD的发病产生直接影响，且不同地域、种族或同种族不同地域人口的CAD易感性具有差异[9]。全基因组关联分析检测到GUCY1A3基因座常见的非编码区突变与CAD之间具有很强的关联性[10]。GUCY1A3基因是编码sGC的α1亚基，sGC是NO-sGC-cGMP信号转导通路中的关键酶，大部分以α1/β1异二聚体的形式广泛分布于许多实质脏器及各种组织细胞中[11]。当体内的sGC被NO激活，激活的sGC可以将GTP转化为cGMP，后者则作为细胞内调节信息的传递者，介导舒张血管、降低血压及促进Na+排泄等正常生理活动[12]。动物实验研究也证明，若将大鼠的sGCα1、α2或sGCβ1基因敲除，其血管平滑肌舒张、血压调节及血小板聚集等方面的功能均会较正常对照组产生不同程度的紊乱，部分会发生严重疾病，甚至死亡[13]。与之类似，心血管系统疾病患者体内的NO-sGC-cGMP信号通路也常为紊乱状态，其根本原因是NO在病理状态下被清除，导致通路中最重要的第二信使cGMP无法被正常激活，从而不能发挥其正常生理功能[14]。综上，NO-sGC-cGMP通路在心血管疾病的发生和发展过程中显得尤为重要，其将成为多种心血管系统疾病（如冠心病、心肌梗死、心力衰竭和慢性肺心病等）有效治疗靶标[15]。

本研究结果显示，入选的研究对象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所收集的样本基本能代表延边地区汉族人群GUCY1A3基因多态性分布。本研究中冠心病组GG基因型频率高于对照组，而对照组GA+AA基因型频率高于冠心病组，有差异。应用Logistic回归分析排除年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟史、收缩压、舒张压该混杂因素的作用后，有差异，与基因型为GA+AA者比较，基因型为GG者其患CAD的危险性增加，表明GG基因型很可能是延边地区汉族人群冠心病发病的易感基因型。GUCY1A3基因位点rs7692387的A等位基因频率分布在对照组中高于CAD组，而G等位基因频率分布在CAD组中高于对照组，有差异。应用Logistic回归分析排除年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟史、收缩压及舒张压该混杂因素的影响后，有差异，与携带G等位基因比较，携带A等位基因可降低冠心病的患病风险，表明A等位基因可能是延边地区汉族人群冠心病的保护性基因。

本研究在一定程度上为冠心病易感人群的筛选及保护提供理论依据，从而根据不同个体的基因多态性实施针对性的早期干预，对冠心病的预防及个性化治疗具有重要意义。同时由于国内外对GUCY1A3基因位点rs7692387的研究较少，该试验的结果仍需在扩大样本含量的基础上，对不同种族、不同地域的人群进行更加深入的研究。

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