固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验

樊 佳， 林文和， 郭子玮， 董文捷， 李蕊晗， 耿 含， 汪 红

(四川大学 生物科学实验教学中心， 四川 成都 610065)

固氮菌在自然界广泛分布于土壤和水中，可以固定转化空气中的氮气，是生物固氮的重要微生物资源，在自然界中的氮素循环起重要作用，可有效提高土壤的氮素，对增加粮食产量，具有巨大的现实意义[1-5]。固氮菌形态特征明显，经分离培养后，成对的菌体呈“∞”排列，在它的细胞壁外面有一层黏液状的物质——荚膜，在染色后可清晰分辨[6]。固氮菌在自然界中分布广泛，容易获取，染色后形态特征明显，是微生物教学中使用的常用菌种。

微生物学是一门实验性和应用性很强的学科，随着分子生物学、遗传学等学科的迅速发展，微生物的研究方法已成为生物学科研究的基本技术和手段[7-9]。因此，开设从土壤分离固氮菌和荚膜染色实验很有必要，可以锻炼学生对微生物实验的操作技能，培养学习兴趣。目前，在微生物教材中，未介绍固氮菌的分离方法，且固氮菌不易保藏，需实验教师临用前分离，学生无法知道实验菌的来源。为此，开设固氮菌分离及其荚膜染色综合实验，让学生自己分离菌株后，再进行染色和观察固氮菌的形态特征。目前教科书上的染色方法不易于学生掌握，成功率低，因此在荚膜染色方法上进行了改良，改良后成功率大大提高，学生易操作和观察。通过开设微生物综合性实验，不仅能提升学生的实验操作能力，还能考察学生对微生物所学知识的运用能力，激发学生的创新思维，并在微生物教学上获得学生的普遍好评。

1 仪器及器材

仪器:生化培养箱LRH-250A型，电子天平BS224S型，高压灭菌锅LDZX-30KBS型，超净工作台SW-CJ-1F型，冰箱BCD-301型。

器材:玻璃试管，培养皿，移液枪(5 mL，1 000 μL、200 μL、10 μL)、酒精灯、锥形瓶、三角推棒、接种环、1.5 mL EP管。

2 实验材料及试剂

实验材料：新鲜土壤。

无氮培养基:甘露醇(葡萄糖)10 g，KH2PO40.2 g，CaSO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO30.2 g，MgSO40.2 g，琼脂20 g，1 000 mL蒸馏水，pH7.2，121 ℃高压灭菌20 min。

实验试剂：齐氏石炭酸复红染液:混合A液及B液即成。A液:碱性复红 0.3g，95%乙醇 10 mL；B液:石炭酸 5 g，蒸馏水95 mL。

黑色碳素墨水溶液:黑色碳素墨水与蒸馏水体积比为3∶1。

3 实验方法

3.1 样品采集

铲取地表约2～3 cm土层，采集新鲜土壤5 g，置于已灭菌的培养皿并送至实验室。

3.2 固氮菌的分离

3.2.1 直接法分离固氮菌

按无菌操作要求，在火焰上灼烧镊子灭菌，冷却后夹取米粒大土壤，均匀放置在固氮培养基平板上，并加0.1 mL无菌水在土壤上；正置10 min后，倒置放于28 ℃培养箱中培养3 d。

3.2.2 梯度稀释法分离固氮菌

按无菌操作要求，取5 g新鲜土壤加入50 mL无菌水中，振荡混匀后静置15 min，此液稀释度为10-1；用移液枪吸取0.5 mL土壤上清悬液于第一支4.5 mL无菌水中，此液稀释度为10-2；以此类推制成10-3、10-4几种稀释度的土壤稀释液[7]；将各稀释度的菌液用移液枪分别吸取0.2 mL于无氮培养基平板上，将三角推棒在酒精灯火焰上充分灼烧灭菌；冷却后将悬液涂布均匀，正置3 min后，倒置放于28 ℃培养箱中培养3 d。

3.3 纯化固氮菌

观察28 ℃培养3 d的固氮菌分离培养平板，用接种环挑取透明状黏稠的褐色固氮菌可疑菌落于无氮培养基进行划线分离，然后倒置放于28 ℃培养箱中培养2～3 d;经过镜检后，再将纯化的固氮菌接种于固氮斜面培养基中，在28 ℃培养箱中培养2～3 d备用。

3.4 固氮菌的荚膜染色

取一片干净载玻片，滴加一滴蒸馏水于载玻片中央，将接种环在酒精灯火焰上充分灼烧，冷却后挑取少量固氮菌(菌不宜多)于蒸馏水滴中，充分分散菌体;放在37 ℃左右的培养箱干燥，干燥后滴加适量齐氏石炭酸复红原液染液，使其覆盖在固氮菌涂片表面，染色2～3 min后，用自来水缓慢冲洗染液至淡红，用吸水纸把多余的水吸掉，使载玻片表面留有少量水分；从载玻片一端滴加1～2滴黑色碳素墨水溶液，轻轻晃动载玻片，使黑色碳素墨水溶液均匀分布于载玻片上，然后对准日光灯光照，将载玻片上的多余黑色碳素墨水溶液用吸水纸吸掉，让光线能够透过即可；最后在37 ℃左右的培养箱干燥后，油镜下观察菌体形态和荚膜特征。

4 实验结果

4.1 直接法分离得到初步的固氮菌

将采集的土样按上述方法进行分离，结果显示可以得到初步分离的固氮菌(见图1)。

图1 直接法分离得到初步的固氮菌

4.2 梯度稀释法分离得到初步的固氮菌

将采集土样按梯度稀释法进行分离后得到初步的固氮菌(见图2)

图2 梯度稀释法分离得到初步的固氮菌

由图2可看出：稀释度为10-1时，菌落黏稠，表面光滑，分布较密集，部分菌落为浅褐色；稀释度为10-2时，菌落黏稠，表面光滑，分布较稀疏，部分菌落为浅褐色；稀释度为10-3，菌落黏稠，表面光滑，数量少，无褐色菌落；稀释度为10-4，菌落黏稠，表面光滑，数量极少，无褐色菌落。

4.3 固氮菌的纯化

将初步分离得到的固氮菌多次划线分离后得到纯的固氮菌(见图3)。

图3 划线分离纯化后的固氮菌

4.4 荚膜染色

改良后的荚膜染色，黑色背景较均匀，固氮菌菌体呈红色，而荚膜不着色，可清晰地观察到菌体呈“∞”型排列，见图4。

图4 固氮菌荚膜染色

5 讨论

在现有的微生物学实验课程中，细菌荚膜染色已作为微生物染色镜检技术中的一个重要组成部分被编入教学内容中。在实际教学过程中，现有课程体系多为分章节针对性训练，因此一般由教师提前为学生准备好菌种等材料，学生直接使用实验菌培养物进行染色操作和观察结果，因而学生对菌种来源不清楚。虽然微生物实验课程中也有细菌分离纯化等内容的训练[7]，但分离得到的细菌不会用于后续实验内容，这样使课程内容过于片段化，降低了课程内容间的关联和技能训练的连续性。

开设的“从土壤中分离培养固氮菌及其荚膜染色”的综合实验，使学生亲自参与土壤采集、固氮菌的分离、纯化和荚膜染色等过程，并针对实验具体细节进行一系列的改良和优化。一是土壤采集的问题，固氮菌在干燥的土壤中不易存活，在实际课程开设过程中，若采土壤前下过雨，则可直接取土样，并将样本直接放在无氮培养基中培养，省去土壤湿润及梯度稀释法分离步骤，操作简便快捷；如果采集的土壤为晴天且干燥，则取样后将新鲜土壤用无菌水湿润，并放在无氮培养基中培养或采用梯度稀释法分离。二是分离时所用的无氮培养基平板要厚(体积约40 mL)，培养时能够较长时间保持土壤湿润，利于固氮菌的生长。三是在染色过程中，采用平铺法代替原有的推片法，即轻轻晃动载玻片使黑色碳素墨水自然流动均匀铺开，在光线下呈均匀半透明黑为宜。该改良后的方法染色背景均匀，色度适中，不会破坏菌膜表面，学生容易观察到荚膜，新方法与传统的推片法相比，操作更简便、成功率高、效果更好，提高了微生物教学实验的效率。

6 结语

综合性实验不仅包括了原有的荚膜染色内容，还涉及到样品采集、培养基配制和细菌分离纯化等步骤[9-12]，且均由学生独立完成，使学生综合应用微生物知识的能力得到锻炼，为其以后从事科研课题研究打下坚实的基础。

通过开设固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验，不仅提升学生的独立实验操作技能，而且培养了学生综合应用微生物知识的能力，激发学生对微生物学习的积极性和主动性。

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