NOS2基因单核苷酸多态性与单纯尘螨过敏性鼻炎相关性研究

李景云 张 媛 张 罗， 2*

(1. 首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉头颈科学重点实验室 鼻病研究北京市重点实验室,北京 100730；2. 首都医科大学附属北京同仁医院鼻过敏科，北京 100730)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis， AR)是由IgE介导的鼻黏膜炎性反应，是耳鼻咽喉科的常见病、多发病，已成为全球性的公共健康问题。AR在全世界范围的发病率为23%，我国中心城市的自报患病率为8.7%～24.1%[1]。AR是一种复杂性疾病，受遗传因素和环境因素的共同影响。研究[2]显示，一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种高脂溶性小分子气体，既可参与鼻黏膜免疫功能，又可作为非肾上腺素能非胆碱能神经递质参与对鼻黏膜血管的调节，还具备调控鼻黏膜纤毛运动的功能，从而参与AR发病过程。其中，一氧化氮合成酶2(nitric oxide synthase 2， NOS2)是NO生成过程中的关键酶，对产生和维持高浓度的NO尤为重要。本研究通过检测单纯尘螨过敏性鼻炎(house dust mite-sensitive allergic rhinitis，HDM-sensitive AR)患者NOS2基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)改变，从而分析其与AR易感性之间的关系。此外，通过测定患者血清总IgE浓度，并分析其与NOS2基因多态性的关系，以了解变应性因素与NOS2基因多态性有无关联。

1 资料与方法

1.1 临床资料

根据我国AR诊断和治疗指南[3]，选取2010年2月至2012年2月间就诊于首都医科大学附属北京同仁医院AR诊疗中心的单纯尘螨(屋尘螨和粉尘螨)AR患者385例，其中男性173例，女性212例，年龄4～71岁，年龄中位数为26岁；同时募集健康对照受试者424例，其中男199例，女225例，年龄18～80岁，年龄中位数为35岁。所有AR患者均出现鼻塞、清水样涕、鼻痒和喷嚏症状中2项或2项以上；查体可见鼻黏膜苍白、水肿和清水样分泌物；变应原皮肤点刺试验(skin prick test， SPT)单纯尘螨阳性，且每当有尘螨暴露史，均出现鼻腔症状。所有健康对照受试者均无鼻腔症状，SPT试验阴性，且吸入性过敏原过筛试验阴性。本研究所有入选者均为北京地区居住的中国汉族人群，均不伴有其他过敏性疾病如哮喘、特应性皮炎等。本研究经首都医科大学附属北京同仁医院医学伦理委员会(批准文号：V20100207.0)审议通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1)SPT试验：SPT试验及分级方法参照以往文献[4]进行，所有AR入选者单纯尘螨阳性，且SPT分级结果≥1级。2)血清IgE检测：血清IgE检测使用UniCAP100检测系统(瑞典法玛西亚公司)。3)基因组DNA提取：采集受试者肘静脉血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管暂存于-20℃，DNA提取按照基因组DNA提取试剂盒(Roche公司，美国)操作说明进行，-80℃冻存备用。4)SNP位点选择：参考Hapmap网站提供的中国北京地区人群(CHB)覆盖候选基因范围内的标签SNP信息(Hapmap第Ⅱ+Ⅲ阶段2009年2月数据，http://www.hapmap.org)[5]，并利用Haploview 4.1软件[6]将Hardy-WeinbergP值，劣势等位基因频率(minor allele frequency， MAF)及r2分别设置为0.01、0.05及0.8，进而得到代表NOS2基因的标签SNP位点，即rs2297516、rs7406657、rs3794764、rs2872753、rs2779249和rs3794766共计6个位点。5)SNP分型：选择MassARRAY实验平台(美国Sequenom公司)实现SNP分型检测，将点好样品的芯片放入质谱仪进行检测分析，利用Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 人口学特征

AR患者组与正常对照组在性别组成上差异无统计学意义(χ2=0.325，P=0.569)，而AR组平均年龄显著低于对照组，差异具有统计学意义(Z=-11.474，P<0.001)。

2.2 个体SNP相关性分析

1)Hardy-Weinberg平衡检验：所有候选位点均通过Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.01)并用于后续的遗传相关性分析。

2)等位基因频率差异比较：单位点相关性分析显示NOS2基因上的6个SNPs等位基因频率在AR患者组与正常对照组间差异无统计学意义(表1)。

3)基因型分布比较：采用Logistic回归分析，在劣势等位基因显性遗传模型下，经校正年龄和性别混杂因素后，结果显示，6个SNPs位点中，仅rs3794764位点的基因型分布在AR患者组和正常对照组间差异有统计学意义(P=0.047)；rs3794764的AA+AG基因型相对GG基因型是AR的危险因素(OR=1.413，95%CI：1.005-1.987)，具体结果详见表2。

4)连锁不平衡(linkage disequilibrium， LD)分析及单倍型构建：LD分析结果显示6个候选SNPs位点之间不存在连锁不平衡(图1)。

5)单倍型分析：单倍型分析未见任何一组单倍型与AR发生相关，具体结果详见表3。

2.3 NOS2基因SNPs与血清总IgE浓度的相关性分析

采用多元线性回归分析，在劣势等位基因显性遗传模型下，经校正年龄和性别混杂因素后，结果显示，在健康对照人群中，rs3794766位点的TT+CT基因型血清总IgE(Log转化后)浓度(1.646±0.045)ku/I较CC基因型(1.521±0.028)ku/I明显增高， NOS2-rs3794766基因型与血清总IgE浓度具有相关性(P=0.019，β=-0.131， 95%CI：-0.229～-0.021)，详见表4。在AR患者中，各候选SNP位点基因型与血清总IgE浓度均未见相关性(P>0.05)，详见表5。

表1 NOS2基因SNPs等位基因频率在AR病例组和对照组间的比较Tab.1 Allele frequencies of SNPs in NOS2 between AR patients and control subjects n(%)

表2 NOS2基因SNPs基因型分布在AR病例组和对照组间的比较Tab.2 Genotype distribution of SNPs in NOS2 between AR patients and control subjects n(%)

图1 NOS2基因SNPs位点及连锁不平衡区块结构Fig.1 Graphical representation of SNPs locations and linkage disequilibrium(LD) structure in NOS2

Left: The measure of LD(D’) among all possible pairs of SNPs was shown graphically according to the shade of color， where white represented very low D’and scarlet represented very high D’. The numbers in squares were D’values(D’×100);Right: The measure of LD(r2) among all possible pairs of SNPs was shown graphically according to the shade of color， where white represented very low r2and black represented very high r2. The numbers in squares were r2values (r2×100).

表3 NOS2基因SNPs单倍型分析Tab.3 Haplotypic association of SNPs in NOS2 with AR n(%)

表4 健康对照NOS2基因SNPs与血清总IgE浓度的相关性分析Tab.4 Association between SNPs in NOS2 and total serum IgE level in control subjects

表5 AR患者NOS2基因SNPs与血清总IgE浓度的相关性分析Tab.5 Association between SNPs in NOS2 and total serum IgE level in AR patients

3 讨论

AR是一种受遗传和环境因素共同作用的疾病，两种因素在AR的发生过程中均占有重要地位。关于AR的遗传学研究，近年来有关基因多态性与AR发病之间的相关性研究越来越多，多种基因包括白介素及其受体编码基因、趋化因子及其受体编码基因、嗜酸性粒细胞过氧化酶编码基因、白三烯/脂氧合酶通路相关编码基因的多态性均已证实与AR发病有关联[7]，本实验室以往的研究[8]也证实T辅助(T helper， Th)2类细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin， TSLP)基因的单核苷酸多态性与AR发病无相关性；人类疱疹病毒4型诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)的rs428253位点的CG/CC基因型是AR发生的保护因素，rs3761548-rs4824747的AG基因型与AR发病风险相关[9]。

NO是生物体内重要的信使分子和效应分子，参与体内众多的病理生理过程。NOS是NO生成过程中的关键酶，根据NOS的组织和细胞来源分为3种类型：神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)，其中nNOS和eNOS主要负责基础NO合成，被激活后仅引起NO少量短期的增加，参与信号传递，调节各种生理功能；而NOS2基因编码的iNOS则多在炎性疾病时被细胞因子或免疫微生物刺激激活，激活后会合成大量NO，作用时间长达几个小时，在机体防御机制中发挥一定作用，但是由于iNOS常一诱发就难以收拾，造成NO的过度制造，继而会引发一系列病理过程[10]。研究[11]显示，AR患者呼出气体中NO浓度增高，其可能的原因是变应原刺激鼻黏膜内iNOS活性增加，因而NO释放增加，参与继发的炎性反应。此外，AR患者鼻甲黏膜组织中iNOS阳性细胞较正常鼻甲黏膜组织明显增加；AR患者鼻黏膜上皮、腺上皮及巨噬细胞增生，并且iNOS mRNA 表达高度增强。这些研究提示，iNOS/NO通路在AR的发病过程中可能发挥了重要作用。

NOS2基因位于17号染色体上，全长37kb，含26个外显子，在外显子2上有转录起始点，外显子26上有终止密码。其启动子区含有多种细胞因子诱导的转录因子结合位点，也是细胞因子诱导的启动子活性所必需的。NOS2基因启动子有多个重叠的、开放的阅读框架，启动子的多态性很可能影响iNOS的表达[12]。尽管NOS2基因多态性在不同人群中被证实与多种疾病包括类风湿性关节炎[13]、哮喘[14]、糖尿病视网膜病变[15]具有相关性。AR和哮喘被认为是“同一气道，同一疾病”，两者关系十分密切[16-17]。Bouzigon等[18]在法国哮喘人群中开展的一项3种NOS基因多态性与引发哮喘状态呼出NO表型的相关性研究显示，NOS2基因多态性与呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide， FeNO)和血浆、呼出气冷凝液(plasma and exhaled breath condensate， EBC)亚硝酸-硝酸盐浓度相关。一项在日本人群的研究[14]报道了NOS2基因启动子区的CCTT短串联重复多态性与未治疗哮喘患者FeNO浓度相关。但是，关于NOS2基因多态性与AR发病的相关性尚无研究报道。本研究中笔者首次发现，在中国北方单纯尘螨过敏AR人群中，NOS2基因多态性与AR发病有一定的相关性，NOS2-rs3794764的AA+AG基因型相对GG基因型是AR的危险因素(OR=1.413，95%CI:1.005～1.987)；此外，在健康对照人群中，NOS2-rs3794766基因型与血清总IgE浓度具有相关性，其中，rs3794766位点的TT+CT基因型血清总IgE浓度较CC基因型明显增高，差异有统计学意义。

综上所述，本研究初步探讨了NOS2基因多态性与HDM-sensitive AR的关系，笔者发现NOS2-rs3794764位点多态性可能与中国北方人群尘螨过敏有一定的相关性，此外，NOS2-rs3794766基因型与血清总IgE浓度具有一定的相关性，提示NOS2-rs3794766多态性与变应性因素有一定的关联。这个结果可为进一步研究AR的发病机制、预防和预测AR发生提供理论依据，但由于本研究样本数量有限，尚需扩大样本量来印证结果的可靠性。

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