慢病毒载体表达系统的研究进展

辛凌翔　常迪

摘要：作为运载工具，慢病毒载体将插入的目的基因导入至宿主细胞内，目的基因由此可于宿主细胞内进行复制或表达，因其具有广阔的宿主范围且能更加有效地引起细胞感染而被视为常用的基因导入方式之一。本文围绕慢病毒载体的构成、慢病毒载体表达系统的优势及演变等，开展相关研究状况的系统综述。

关键词：慢病毒载体；病毒包装；基因表达

慢病毒（Lentivirus）为二倍体RNA病毒，属逆转录病毒科（Retrovidae），其感染特征为经显性或隐性感染后，潜伏期较长，感染动物发病缓，常见的有：HIV（人类免疫缺陷病毒）、FIV（猫免疫缺陷病毒）以及EIAV（马传染性贫血病毒）等。慢病毒于宿主细胞中第一步会通过自身反转录酶作用，结合病毒RNA产生eDNA；第二步是将上一步骤所得eDNA当做模板，由此产生双链DNA；第三步，经过双链DNA环化反应，同时通过病毒整合酶作用，在宿主细胞染色体上依次进行整合与表达翻。

1慢病毒载体的结构

慢病毒载体作为重组逆转录病毒载体的一类，其基础为慢病毒，其病毒基因组内含有关系到病毒活性以及病毒复制的重要序列，去掉此类序列，再根据试验需要，在其基因组骨架中插入目的基因的序列，这样既可以保证其生物安全性，又能达到基因转移的目的。就整个慢病毒载体系统而言，应用率最高的为HIV载体系统，且所获研究成果最多的为HIV-1型载体系统。以HIV-1的基因结构为例，HIV-1属双链RNA病毒，共含9个基因（如图1所示）。

编码病毒结构蛋白的基因主要有gag、pol和env。其中，gag负责编码合成衣壳蛋白、内膜蛋白以及核衣壳蛋白等关键蛋白，pol负责编码病毒复制相关酶，env负责编码病毒包膜糖蛋白。

编码病毒调节蛋白的基因主要有rev和诅t。rev参与调节蛋白的表达，tat参与控制蛋白的转录。LTR为病毒的长末端重复序列，其内存在顺式作用原件，LTR结合tat后能对病毒基因转录起促进作用。vif、vpr、vpu、nef为辅助基因，将辅助基因编码的蛋白当做毒力因子，可用来主导宿主细胞的感染以及識别。此外，在构成上，HIV-1的基因组还提供了病毒整个生命周期涉及到的其他序列结构，诸如包装信号、病毒复制信号等。

2慢病毒载体表达系统的优势

在所有外源基因导入细胞的方法中，应用较为广泛的有DEAE-葡聚糖转染技术、磷酸钙转染技术、聚阳离子-DSMO转染技术、电穿孔技术、显微注射技术、原生质体融合技术等。在外源基因表达中发挥关键作用的病毒表达载体现已成为应用率最高的基因导入工具之一，包括逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及腺病毒载体等。慢病毒载体因其具有转染细胞广泛、感染效率高、导入基因片段量容量大且表达稳定等诸多优点，被视为理想的可转移目的基因的逆转录病毒载体，在疫苗研发、药物开发等领域有着广泛的应用阎，其具体优势如下：

2.1转染细胞广泛

不管细胞分裂活跃与否，抑或细胞处在哪个分裂阶段，慢病毒载体都能够保持转染的广泛性，尤其对于原代细胞、干细胞、不分化的细胞等较难转染的细胞（如造血干细胞、神经干细胞、肌纤维细胞等）均具有高效的基因转导效率，由此，愈来愈多的针对相关疾病基因疗法的临床研究开始大量应用慢病毒载体。有试验发现，不管是体外进行的细胞与组织培养研究，或是体内进行的基因治疗研究，对于神经胶质细胞或神经元，慢病毒载体均表现出转染的稳定性与高效性。

2.2导入基因表达稳定

研究发现，不管是体内移植试验，还是体外细胞培养，以慢病毒载体导入的目的基因均可以有效地抵抗转录沉默影响，同时，可以于靶细胞内保持表达的稳定性及持续性。

2.3可兼容多个转录启动子和增强子

慢病毒载体能兼容若干启动子，诸如管家基因启动子、细胞特异性启动子等，由此确保载入的目的基因可以稳定表达于特定组织细胞内，从而提高转入基因的转录靶向性。

2.4转移基因片段容量大

慢病毒在改建后，能够携带10 kb左右的外源基因，故大部分cDNA均可以被慢病毒载体携带，，只有小分子不能，诸如外源shRNAs等。而值得一提的是，慢病毒病毒滴度一般会随着目的基因的增长而降低。

3慢病毒载体表达系统的演变

慢病毒载体在早期由HIV改装而来，包括两类载体系统：HIV-1型、HIV-2型。其后，在研究不断深入下，大量种类各异的慢病毒载体系统被慢慢开发出来，如猿类免疫缺陷病毒（SIV）载体系统、牛免疫缺陷病毒（BIV）载体系统、马传染性贫血病毒（EIAV）载体系统等。在基因转染方面，各物种细胞内相对应的物种载体系统可能有效性更佳，但是，各物种种类的细胞间能不能交叉应用慢病毒载体，还需要依据更多、更深入的试验进行论证和评估。此外，从病毒滴度以及生物安全性等角度分析，慢病毒载体应用也存在一定的局限性。

在设计慢病毒载体的结构时，应遵循以下基本原则：使载体靶向性更强、使转基因表达效率更高、使生物安全性有所保障等。当进行HIV-1载体构建时，为了防止有复制能力的病毒（RCV）形成，通常先把HIV-1基因组分装至多个质粒内，这些质粒共转染细胞后即获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒。故而，基于质粒的个数，可把慢病毒载体表达系统发展史分成下述3个过程：

3.1二质粒表达系统

此系统构成部分有两个：包装成分、载体成分。设计该系统时，一是分离存在于HIV-1基因组的编码反式作用因子以及顺式作用元件（含包装成分），二是对病毒自身的包装成分与LTR进行全部或部分的保留，同时将编码反式作用因子序列尽量去除掉，由外源基因代替。故而，此类缺陷型重组病毒复制必需要有其他病毒辅助，这些辅助病毒自身无法增殖。由此类表达系统内的二质粒对细胞进行共同转染，即可以形成无复制能力且具感染功能的载体颗粒。不过，在转染的过程中二质粒表达系统中的载体成分与包装成分的病毒DNA可能会发生简单的重组，这种重组将存在产生具有复制能力的HIV-1病毒的安全隐患。

3.2三质粒表达系统

此系统含转移质粒、异源包膜质粒与包装质粒。为了更为有效地防止感染性病毒形成，针对包装质粒，由CMV（巨细胞病毒）启动子来替换5'LTR，由人B-珠蛋白poly-A信号序列来替换3'LTR。包装质粒不产生辅助蛋白VPU与病毒包膜蛋白，然而可表达复制所需的全部反式激活蛋白。此外，针对包膜质粒，由VSV（水疱性口炎病毒）糖蛋白G替换HIV-1自身的包膜蛋白，由此产生异源包膜蛋白质粒，由于VSV的G受体大量分布在若干类细胞表面，由此增强了慢病毒载体的宿主细胞倾向性。更换包膜能够更为有效地抑制HIV-1载体发展为野生毒，还使得病毒载体滴度提高与稳定性增强，同时实现了病毒浓缩技术的简单化。

3.3四质粒表达系统

在过去的几年内，此系统慢慢发展起来，由此更为有效地增强了慢病毒载体表达系统的安全性，同时对感染效率不产生影响。此系统所含的四个质粒及其功能如下：第一个质粒发挥组装功能，编码形成病毒颗粒所必需的蛋白，全部pol以及gag序列包括在此质粒内，且去掉了4个辅助基因。第二个质粒含具整合、逆转录以及组装功能的反式作用序列因子，此质粒为病毒载体最为关键的部分，包括RRE、LTR。第三个质粒负责编码翻译合成VSV的糖蛋白G。第四个质粒含曾经包含在组装质粒内rev序列。在慢病毒的制备中，把四个质粒一同转染到细胞中，使其大量增殖，最终获得大量表达质粒。

4问题与展望

随着研究的逐步深入，慢病毒载体表达系统正在被不断改进，改进的目标主要在于如何使载体颗粒具有更为广泛的感染能力并丧失复制能力。对于三质粒和四质粒表达系统而言，其中的包装信号被删除，由此导致包装序列无法整合至病毒基因组内，病毒感染宿主细胞后不能复制，更不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，故而，现今应用率更高。然而，因为人类是HIV-1慢病毒载体的主要宿主，在生物学领域应用慢病毒载体表达系统依然存在潜在风险。未来在设计与改良慢病毒载体表达系统方面，针对包装质粒，可尝试继续缩短其病毒编码序列长度，由此使病毒基因重组的可能性降低。此外，还需要进一步探索如何促使病毒滴度提高，使慢病毒载体表达系统在各领域的研究中应用更为便捷与广泛。endprint