童亚莉,李可欣,田舒菡,3,梁涛,3,*
1. 中国科学院地理科学与资源研究所,北京 100101 2. 中国科学院大学,北京 100049 3. 中国科学院大学中丹学院,北京 100190 4. 北京市劳动保护科学研究所,北京 100054
从20世纪60年代初,经过50多年的发展,中国已成为世界上最大的稀土生产国、稀土产品消费国和出口国。随着稀土资源的大量开发,稀土元素(rare earth elements, REEs)不可避免地通过各种方式和途径进入到环境中[1]。稀土粉尘进入人体后,对人体存在着一定的致病作用,毒性的大小与稀土元素的形态、浓度等有关[2]。已有流行病学和体内外实验数据表明,长期的稀土环境暴露,会加重人体肝、肾负担,并对人体的某些免疫功能产生一定的负面影响[3]。距离稀土矿区越近的居住区儿童智商均数、记忆力均较对照组明显低下,并且重稀土可能比轻稀土更易在大脑蓄积或毒性更大[4-6]。稀土粉尘通过呼吸道进入人体内,大部分粉尘沉积在呼吸道和肺部组织,引发炎症,严重者患上尘肺病和间质性肺病等疾病[7]。刘建国等[2]对稀土粉尘作业人员检查发现,肺功能异常率显著高于对照组。从事稀土金属生产的工人有呼吸道及皮肤病变、肺纤维性变、血小板下降等病状[8],尿液中稀土含量显著高于对照组[9]。邹彤彤等[10]对CeO2、包钢混合稀土、硅铁合金、Y2O2及富钇5种粉尘的细胞毒性检测发现,5种粉尘均具有一定的细胞毒性,并具有明显的剂量-反应关系。Ma等[11]对小鼠进行CeO2纳米颗粒物注射发现,肺泡 巨噬细胞分泌的IL-12和IFN-γ增多,表明CeO2纳米颗粒物会对健康产生不利影响。Cassee等[12]通过对小鼠注射Ce-DEP颗粒物同样发现,Ce-DEP暴露增加了小鼠脑部和肝脏的促炎症因子水平。
包头市是典型的稀土矿工业城市,拥有全球最大的轻稀土矿——白云鄂博稀土矿[13]。大规模的稀土开采、冶炼和加工,以及干燥、少雨、多强风的天气状况,造成了包头市严重的大气颗粒物污染和大气环境中高稀土背景值。目前,国内外关于大气颗粒物的细胞毒性研究多关注以北京、天津为代表的等机动车保有量大、二次污染严重的大中城市,缺乏对工业城市尤其是以矿产资源开发为主的城市的大气颗粒物研究[14-16]。随着稀土资源的开采和利用程度越来越高,环境和人类暴露增加,对稀土与人体健康的研究尤为重要。因此,本研究采集了典型稀土矿工业城市包头市春、夏季的PM10样本,将人肺上皮A549细胞暴露于PM10颗粒物样品和标准颗粒物1649b(Standard reference material, SRM1649b),从细胞活性、氧化应激和DNA损伤3个方面来研究包头PM10对A549细胞暴露后所产生的毒性作用。
PM10采样器(崂应2036,青岛崂山应用技术研究所,中国),石英纤维滤膜(MK360,Munktell公司,瑞典),超声清洗器(Branson 1510,Branson公司,美国),离心旋转冷冻蒸发仪(Power Dry-RC1010,Thermo Scientific公司,美国),电感耦合等离子体质谱(IPC-MS,ELAN DRC-e, Perkin Elmer公司,美国),电子天平(Sarius CP225D,Sartorius AG公司,德国),电热板(DRB07-600B,济南精密科学仪器仪表有限公司,中国),超纯水器(UPW-20S,北京历元电子仪器贸易公司,中国),细胞培养箱(HERACELL 150i, Thermo Scientific公司,美国),显微镜(CX23,Olympus公司,日本),24/96孔细胞培养板(φ=15.6 mm 和4.5 mm,Corning公司,美国),细胞计数器(CASY®1,Innovatis公司,美国),超净台(Holten LaminAir, Holm & Halby公司,丹麦),酶标仪(Multiskan FC,Thermo Scientific公司,美国),荧光和化学发光分析仪(Fluoroskan AscentTMFL,Thermo Scientific公司,美国),荧光显微镜(CKX41,Olympus公司,日本),SRM1649b(美国国家标准技术协会),GelBond®膜(Cambrex, Medinova Scientific A/S, Hellerup,丹麦),F-12培养基(Gibco公司),胎牛血清(Gibco公司),谷酰胺(Gibco公司),青霉素/链霉素双抗溶液(Gibco公司),胰蛋白酶(Gibco公司),磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)(Gibco公司),Hank’s溶液(Gibco公司)、Triton X-100(Gibco公司),WST-1试剂(曼海姆,德国),2'7'-二氯荧光素二醋酸盐(2’7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)溶液(Gibco公司),硝酸、氢氟酸、高氯酸(优级纯,北京化工厂)。
1.2.1 大气颗粒物样品的采集
PM10分别采集于包头典型稀土矿地区4个具有代表性的功能区(图1),分别为白云鄂博矿区、工业区、包头市中心区和包头市居住区。采集时间为2014年4月和2013年8月。采样滤膜为石英纤维滤膜,采样流速为100 L·min-1,采样期间如遇到雨水天气,则需等雨停3 d之后再进行采集。采样后,用干净镊子将样品膜取出,对折放入铝箔中,密封好,带回实验室,放入-20 °C 冰箱保存,用于后续颗粒物提取。
1.2.2 大气颗粒物提取
将载有颗粒物的石英纤维滤膜对折,沿垂直于折叠线的方向将滤膜剪成两半,将其中一半滤膜放入50 mL塑料管中,加入20~50 mL甲醇保证滤膜被全部没过,放入超声清洗器中超声30 min后,将管中甲醇转移到2 mL的离心管中,在冷冻离心旋转蒸发仪中蒸发甲醇得到颗粒物。称取离心管蒸发前后的质量得到所提取颗粒物的质量,提取率约为81%。石英纤维滤膜对照组的实验结果表明,1 mg颗粒物中最高有25%为石英纤维。根据采样日期,将分别采集于4个功能区的PM10提取物混合为2个PM10暴露样品(PM10-春季,PM10-夏季)。
分别称取5 mg大气颗粒物(PM10-春季、PM10-夏季、SRM1649b),加入5 mL含2%PBS的无菌水,配制成1 mg·mL-1母液于4 ℃冷藏备用。在细胞活性测定中,使用F-12培养基稀释颗粒物母液,在细胞内ROS和DNA损伤测定中,使用Hank’s溶液稀释颗粒物母液。
图1 包头市区位和采样点位图Fig. 1 The location of Baotou City and sampling sites
称取约0.5 mg颗粒物,放入聚四氟乙烯坩埚底部,用洁净的移液管加入适量的硝酸、高氯酸和氢氟酸(硝酸:高氯酸:氢氟酸为2:2:1),盖上坩埚盖子,静置过夜,进行消解。采用ICP-MS分别检测春季和夏季PM10中14种稀土元素含量。电感耦合等离子质谱仪的元素分析条件如下:宝石喷嘴十字交叉雾化器,耐氢氟酸Scott型雾室,EPA检测器,射频发生器功率为1.1 kw,雾化气(氩气)流量为0.83 L·min-1,辅助气(氩气)流量为1.2 L·min-1,溶液提升量为1.2 mL·min-1。用测定标准溶液的操作条件测定样品溶液和空白对照溶液,扣去空白即得样品稀土元素含量。
A549细胞购自美国菌种保藏中心(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),用含10%胎牛血清、谷酰胺和双抗溶液的F-12培养基,于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。采用传代培养方法进行细胞培养。当细胞生长形成的单层达到80%以上时,加入5 mL PBS溶液清洗细胞,然后加入1.5 mL胰蛋白酶消化液并放入培养箱中消化5 min,在显微镜下观察到细胞变圆时,加入10~15 mL培养液终止消化,用吸管轻轻吹打,使细胞脱离瓶壁,转移90%的细胞悬液于15 mL离心管中用于细胞暴露试验,剩下的10%细胞悬液加入10~15 mL培养液,放入培养箱中继续培养。试验中采用10代以内培养的细胞。
细胞活性用WST-1法进行测定[17]。将对数生长期的A549细胞消化、稀释后的细胞悬液接种于96孔全透明细胞培养板中,细胞浓度为5×104个·孔-1,于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。随后弃掉上清液,将颗粒物暴露液按25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1以100 μL·孔-1加入96孔细胞培养板中于培养箱中培养24 h。弃掉所有细胞上清液后加入100 μL·孔-1稀释后的WST-1试剂(使用培养基按100 μL培养基中含10%WST-1试剂稀释),继续培养1.5 h。随后取出96孔板在酶标仪中测定吸光度(测定波长为450 nm,参考波长为630 nm)。试验设计3个平行对照,3个空白对照,3个纤维对照(纤维对照浓度为25 μg·mL-1)和3个阴性对照(Triton X-100),实验于不同日期重复4次。
细胞内ROS产生水平用2’7’二氯荧光素二醋酸盐(2’7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)荧光探针法进行测定[18]。取对数生长期的A549细胞消化、稀释后的细胞悬液,取100 μL·孔-1接种于96孔底部透明黑色细胞培养板中,细胞浓度为5×104个·孔-1,于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。弃掉上清液,加入100 μL·孔-1DCFH-DA染色剂于37 ℃、5%CO2条件下染色15 min,使用PBS 200 μL·孔-1清洗细胞,随后将颗粒物暴露液按25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1以100 μL·孔-1加入96孔细胞培养板中于培养箱中培养3 h。随后取出96孔板在荧光和化学发光分析仪中测定吸光度(激发波长为488 nm,发射波长为525nm)。试验设计3个平行对照,3个空白对照,3个纤维对照(纤维对照浓度为25 μg·mL-1)和3个阴性对照(黑炭,10 μg·mL-1),实验于不同日期重复4次。
细胞内DNA损伤程度用彗星实验测定[19]。取对数生长期的A549细胞消化、稀释后的细胞悬液接种于24孔全透明细胞培养板中,细胞浓度为2.5×105个·孔-1,于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。弃掉上清液,将包头春季PM10和夏季PM10按100 μg·mL-1以0.5 mL·孔-1加入24孔细胞培养板中于培养箱中培养3 h。用胰蛋白酶消化细胞5 min,待细胞均脱离细胞培养板底部后将每个孔里的细胞悬浮液转移到离心管中。所有离心管保证低温环境,避免其他条件造成细胞DNA损伤。用1%的琼脂糖将凝胶格子粘贴到GelBond膜的亲水表面,取75 μL细胞悬液加入600 μL 0.75%的琼脂糖中,充分混合,分别取120 μL均匀地平铺在凝胶格子中,将所有凝胶格子于4 ℃放置15 min。将凝胶格子从GelBond膜上分离下来,并将GelBond膜浸泡到裂解液(2.5 mol·L-1NaCl, 0.1 mol·L-1Na2EDTA, 10 mmol·L-1Trisma base, pH 10, 1% Triton X-100)中,于4 ℃环境下过夜。取出GelBond膜,用无菌水清洗涂有样品的表面3~5次,然后将GelBond膜置于电泳槽中,将新配制的电泳缓冲液(1 mmol·L-1Na2EDTA, 300 mmol·L-1NaOH, pH>13)倒入电泳槽中,保证液面高于GelBond膜表面,于4 ℃环境中静置40 min。调整电泳槽中电泳缓冲液的液面高度,至电压为25 V,电流为300 mA。打开电泳槽开关,电泳20 min。取出GelBond膜放置于中和缓冲液(0.4 mol·L-1Tris base, pH 7.5)中浸泡15 min,随后放入96%乙醇中过夜。每个样品加入50 μL的染色剂YOYO-1 (YOYO®-1 iodide)进行染色,将载玻片轻轻的盖在GelBond膜表面,尽量使染色剂平铺到整个膜表面,待染色剂干透后,于荧光显微镜下观察细胞DNA迁移拖尾情况,根据DNA拖尾程度按1~5类分别进行计数,总数为100个。根据调整校正曲线将计数结果按公式转换为106碱基对(base pairs, bp)中损伤数量[19]。DNA损伤实验设定2个平行对照,于不同日期重复3次。
包头典型稀土矿城市春季和夏季PM10和标准颗粒物SRM1649b中稀土元素质量浓度如表1和图2所示。包头春季和夏季PM10中稀土元素总量(∑REE)分别为(564.20±87.87) mg·kg-1、(1 145.10±323.91) mg·kg-1,分别为SRM1649b中稀土元素总量的3.46倍和7.02倍。SRM1649b中重稀土元素(heavy rare earth elements, HREEs)(除钆Gd、铽Tb)含量高于包头PM10中的含量。包头春季和夏季PM10中轻、重稀土含量比(LREE/HREE)分别为15.19和25.26,稀土元素以轻稀土为主,其中Ce、Pm和Nd含量占稀土总量的50%以上。包头PM10呈现明显的轻稀土元素富集。
从颗粒物来源来看,包头PM10中稀土含量及组成呈现明显的季节性差异。包头夏季PM10中稀土总量高于春季PM10,约为其2倍。除铥(Tm)、镱(Yb)和镥(Lu)3种稀土元素以外,夏季PM10中其他稀土元素含量均高于春季PM10。
包头春季和夏季不同浓度PM10染毒A549细胞24 h后,细胞活性如图3所示。由图可知,A549细胞暴露于25 μg·mL-1纤维24 h后,细胞活性水平为98.4%,与空白对照相比细胞活性没有明显下降,表明试验中纤维对A549细胞的活性并没有明显的影响。A549细胞暴露于包头春季、夏季PM10和SRM1649b不同浓度水平(25,50,100 μg·mL-1)24 h后,细胞活性均有不同程度的下降,并且呈剂量-效应关系。较高暴露浓度(50,100 μg·mL-1)表现出较强的抑制细胞生长作用,100 μg·mL-1暴露下细胞活性水平与25 μg·mL-1时的细胞活性水平相比显著降低(P<0.05)。与SRM1649b相比,包头夏季PM10抑制细胞活性更加明显,但统计学上并没有显著差异(P>0.05);与包头春季PM10相比,夏季PM10对细胞活性的抑制程度更高。
表1 包头典型稀土矿城市春季和夏季PM10和SRM1649b中稀土元素质量浓度Table 1 The concentration of rare earth elements(REEs) on the PM10 of Baotou City in spring and summer and SRM1649b
注:HREE和LREE分别为重、轻稀土元素。
Note: HREE stands for heavy rare earth elements, LREE stands for low rare earth elements.
A549细胞暴露于包头春季和夏季不同浓度PM103 h后,细胞内ROS产生水平如图4所示。由图可知,A549细胞暴露于25 μg·mL-1石英纤维3 h后,细胞内ROS产生水平为89.1%,与空白对照相比没有显著差异,表明试验中石英纤维并没有刺激A549细胞产生更多的ROS。A549细胞暴露于包头春季、夏季PM10和SRM1649b不同浓度水平(25,50,100 μg·mL-1) 3 h后,包头夏季PM10和SRM1649b刺激细胞产生更多ROS,并且呈剂量-效应关系,但包头春季PM10引起细胞内ROS产生量先增加后下降。与SRM1649b相比,包头春季PM10在较低暴露浓度水平(25 μg·mL-1)时诱导A549细胞产生更多的ROS,在较高暴露浓度水平(50,100 μg·mL-1)时诱导A549细胞产生的ROS水平低于SRM1649b,当颗粒物浓度分别为25 μg·mL-1、50 μg·mL-1时,SRM1649b诱导细胞产生的ROS分别比春季PM10多2.56%和45.63%;包头夏季PM10在不同暴露浓度水平下产生的ROS水平均低于SRM1649b。在较低暴露浓度水平(25 μg·mL-1)时,包头春季PM10诱导细胞产生更多ROS,比夏季PM10多32.76%;而在较高暴露浓度水平(50,100 μg·mL-1)时,包头夏季PM10诱导细胞产生更多ROS,分别比春季PM10多3.99%和9.63%。
图2 包头典型稀土矿城市春季和夏季PM10和SRM1649b中稀土元素质量浓度Fig. 2 The concentration of REEs on the PM10 of Baotou City in spring and summer and SRM1649b
图3 包头春季、夏季PM10,SRM1649b和石英纤维(25 μg·mL-1)不同暴露浓度水平下A549细胞活性水平注: *表示与纤维对照组-25 μg·mL-1相比在P<0.05水平下显著差异;不同字母表示不同处理组之间在P<0.05水平下差异显著。Fig. 3 The WST-1 level of A549 cells after exposure to PM10-Spring, PM10-Summer, SRM1649b and fiber (25 μg·mL-1) at different PM concentrationsNote: * presents significantly different compared to fiber control at P<0.05 level; different letters present significantly different at P<0.05 level among different treatments.
A549细胞暴露于100 μg·mL-1浓度的包头春季、夏季PM103 h后,DNA双链损伤程度如图5所示。与春季PM10相比(0.86±0.13),夏季PM10造成A549细胞产生更多双链损伤(1.12±0.13),约为春季PM10双链损伤的1.3倍。与Frikke-Schmidt等[17]试验所得的阳性对照、黑炭(100 μg·mL-1)和Jantzen等[20]试验所得的SRM2975、SRM1650(100 μg·mL-1)相比,包头PM10在相同暴露浓度和暴露时间下,对A549细胞产生更多DNA双链损伤(图5),其中包头春季PM10产生的双链损伤程度约为SRM1650的2.5倍。
图4 包头春季、夏季PM10,SRM1649b和石英纤维(25 μg·mL-1)不同暴露浓度水平下A549内活性氧物种(ROS)产生水平注: *表示与纤维对照组25 μg·mL-1相比在P<0.05水平下显著差异;不同字母表示不同处理组之间在P<0.05水平下差异显著。Fig. 4 The reactive oxygen species (ROS) level of A549 cells after exposure to PM10-Spring, PM10-Summer, SRM1649b and fiber (25 μg·mL-1) at different PM concentrations Note: * presents significantly different compared to fiber control at P<0.05 level; different letters present significantly different at P<0.05 level among different treatments.
图5 暴露于颗粒物100 μg·mL-1 3 h后细胞双链DNA损伤程度注: *表示与对照组相比在P<0.05水平下显著差异;不同字母表示不同处理组之间在P<0.05水平下差异显著。Fig. 5 The DNA damage of A549 cells after exposure to PM at 100 μg·mL-1 for 3 hNote: * presents significantly different compared to fiber control at P<0.05 level; different letters present significantly different at P<0.05 level among different treatments.
图7 大气颗粒物稀土元素与细胞内ROS产生水平相关性分析注: 图中数字的绝对值越大代表与细胞活性相关性越高,数字绝对值越小代表与细胞活性相关性越小。Fig. 7 The correlation analysis of REEs on PM and ROS productionNote: The bigger the absolute value is, the larger the correlation is.
由于包头PM10富集轻稀土元素,因此本文主要分析包头PM10和SRM1649b中轻稀土元素与A549细胞活性和ROS产生水平的相关性,结果分别如图6、7所示。各轻稀土元素均与细胞活性呈负相关性,除La(-0.64)以外,其他6种轻稀土元素Eu(-0.96)、Sm(-0.95)、Pm(-0.89)、Nd(-0.89)、Pr(-0.86)和Ce(-0.83)相关性较高。
各轻稀土元素均与细胞内ROS产生水平呈负相关性。其中,La(-0.85)、Ce(-0.66)和Pr(-0.62)3种轻稀土元素与ROS产生水平相关性较高。
随着社会经济的快速发展,城市大气颗粒物污染已成为城市大气环境污染的重要组成类型。PM10作为城市大气颗粒物污染主要污染物之一,是一种由可溶性盐、金属元素、有机物质和生物组分等组成的混合物质,成分及来源复杂。已有研究和统计数据表明,稀土粉尘对人体健康产生不利影响,因此本研究采集典型稀土矿工业城市——内蒙古包头市春、夏季大气PM10,表征其稀土元素含量及组成,并将人肺上皮A549细胞暴露于PM10和标准颗粒物SRM1649b,从细胞活性、氧化应激和DNA损伤3个方面来研究包头大气PM10对A549细胞的毒性效应。
包头春、夏季PM10表现出轻稀土富集特征,并呈现季节性差异,这与包头市不同季节颗粒物来源、气象条件和地理特征有关。包头PM10中稀土元素平均质量浓度从高到低的顺序为:Ce > La > Nd > Pr > Sm > Gd > Dy > Er > Yb > Eu> Tb > Ho > Tm ≈ Lu,这与白云鄂博矿区周边土壤[21]、动物和植物样品中的稀土元素组成相似[22-23]。包头白云鄂博矿区是中国最大的铁-氟-稀土综合矿床,其中稀土资源以轻稀土为主[24]。从稀土资源的开采到加工,大量高轻稀土含量的粉尘排放到大气环境中,同时,包头干旱少雨,裸露地相对较多,扬尘污染相对较严重,导致包头PM10中轻稀土元素含量较高。与包头春季PM10相比,夏季PM10中稀土元素除Tm、Yb和Lu 3种重稀土元素以外,其他稀土元素含量均高于春季PM10。春季采样期间,遇到两场降雨,降雨有效地降低了矿区矿坑粉尘进入大气环境的可能性。夏季包头市盛行东风(出现频率9.8%),春季盛行西风(出现频率为12.0%),春季风速全年最大[13]。包头春季风速较大、气旋活动频繁,故春季多风沙天气,大量外源沙尘稀释PM10中稀土元素含量,导致包头春季PM10中大部分稀土元素含量低于夏季。Wang和Liang[25]发现,轻稀土更容易富集于细颗粒物上,重稀土更容易富集在粗颗粒物上,所以春季PM10中Tm、Yb和Lu 3种重稀土元素含量高于夏季PM10,而轻稀土元素含量则低于夏季PM10。
结果表明,包头春、夏季大气PM10和SRM1649b均引起A549细胞活性下降,并呈剂量-效应关系,诱导细胞内ROS生成量增加,与春季相比,夏季PM10对细胞活性的抑制程度更高,表现出具有更强的细胞毒性。从单位细胞活性水平产生的ROS量来看,包头春、夏季PM10分别为1.52和1.75,也能证明夏季PM10使细胞产生氧化应激的能力强于春季PM10。与SRM1649b相比,包头春季PM10抑制细胞水平与SRM1649b无明显差异,而较高暴露浓度下SRM1649b相比于包头夏季PM10诱导细胞产生更多ROS,这可能与SRM1649b中其他成分有关。包头PM10与SRM2975、SRM1650[20]和黑炭[17]相比,包头PM10造成A549细胞更多的DNA双链损伤,其中夏季PM10比春季PM10造成更多的双链损伤而表现出更强的遗传毒性,这与Stieb等[26]使用meta分析方法得出的温暖月份的PM10的呼吸系统疾病致死率更高结论一致。
包头春、夏季大气PM10和SRM1649b均引起A549细胞活性下降,并诱导细胞内ROS生成量增加,含稀土大气颗粒物的毒性显著高于标准颗粒物。与春季相比,包头夏季PM10对细胞活性的抑制程度更高,表现出更强的细胞毒性和遗传毒性。本研究的结果表明,大气PM10能够通过氧化应激导致细胞活性下降和DNA损伤,而颗粒物中的微量稀土元素,尤其是轻稀土元素促进了颗粒物的细胞毒性和遗传毒性。但由于实验技术的局限,目前无法实现PM10上稀土元素的剥离,因而还无法单独讨论PM10上稀土组分的毒性效应,下一步研究需要更加关注稀土元素而不是原状大气颗粒物的细胞毒性效应。
致谢:包头可吸入大气颗粒物样品由中国科学院地理科学与资源研究所李可欣老师提供,细胞实验在丹麦哥本哈根大学公共健康学院Peter Møller教授课题组帮助下完成。
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