Apaf-1通过wnt/β-catenin信号通路调控肝癌的机制研究*

郭善军，李 晶，杨宏静△

(1.达州职业技术学院，四川达州 635001；2.重庆三峡医药高等专科学校 404120)

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率位居癌症第6位，且治疗难、预后差、生存率低，因此研究肝癌发病机制对肝癌的治疗具有指导作用[1]。近年来，wnt介导经典的wnt/β-catenin信号通路受到人们的广泛关注，wnt/β-catenin信号通路不仅对脊椎动物的胚胎发育及组织稳态具有重要功能，而且肿瘤的形成与wnt/β-catenin信号通路异常密切相关。该系统的激活可引起β-catenin 在胞浆中的积聚，进而进入胞核与TCF/LEF转录因子结合，激活下游基因的表达。在没有激活的情况下，β-catenin与人糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、Axin、抗原呈递细胞(APC)、蓬乱蛋白1(DVL-1)和蛋白磷酸酶2A(PP-2A)相结合，β-catenin被磷酸化，进而被蛋白水解酶所降解。wnt信号被激活时，GSK3β的活性被DVL-1所抑制，引起β-catenin 的积聚[2]。

凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)是一种新近发现的抑癌基因，参与人体线粒体凋亡途径，作为一种多功能结构域的构架蛋白，通过与wnt/β-catenin信号通路中的其他蛋白分子结合发挥生物学作用[3]。研究证明，Apaf-1在各种恶性肿瘤中都存在启动子高甲基化水平导致其自身表达降低，最终导致wnt/β-catenin信号通路异常引起恶性肿瘤的发生[4]。目前国内外关于Apaf-1在肝癌细胞中的表达及作用机制报道缺乏，因此对于研究Apaf-1基因肝癌作用机制的研究十分必要。本实验通过验证Apaf-1对wnt/β-catenin信号通路的调控、Apaf-1在肝癌细胞中表达和敲降Apaf-1对肝癌细胞的影响来探讨Apaf-1在肝癌细胞中的作用机制，为寻找新的肝癌治疗靶点及防治药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 肝癌细胞株HepG2、HHCC、HB611及正常肝细胞株LO2购自上海奥陆生物科技有限公司，pcDNA3.1质粒、HEK293细胞株来自西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室馈赠，双荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega 公司(Promega,USA)，RNA提取(RNAiso Plus)、反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)和定量PCR试剂盒均来自日本TaKaRa公司，pCDH质粒购自维真生物；抗体购自Bioword公司。

表1 实时定量PCR相关引物

1.2方法

1.2.1验证Apaf-1基因对wnt/β-catenin信号通路调控作用 为了验证Apaf-1基因对wnt/β-catenin信号通路具有调控作用，本研究将人的Apaf-1、β-catenin基因全长cDNA克隆连接到pcDNA3.1质粒，通过细胞转染至HEK293细胞株，转染过程每孔加入0.50 μg TOPFlash报告质粒(判断wnt/β-catenin信号通路是否激活的标志)、0.05～0.50 μg包含Apaf-1、β-catenin全长的pcDNA3.1质粒、100 ng/孔的pRL-TK(pRL-TK表达的海肾荧光素酶作为一个内参因子可以用来判断转染效率，并计算相对荧光素酶活性)，以未进行转染和转染空质粒为空白对照组和阴性对照组，每组3个复孔；转染后48 h收细胞：磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次，每孔加入100 μL裂解液，室温裂解10 min。用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒在在Luminosakan Ascent化学发光分析仪上测定荧光素酶活性[5]。

1.2.2实时荧光定量PCR检测肝癌细胞株及正常肝细胞株中Apaf-1的表达 取对数生长期HepG2、HHCC、HB611及LO2细胞株，用含10% 胎牛血清的DMEM 培养，然后提取各个细胞株总RNA，反转录cDNA，通过实时定量PCR方法检测Apaf-1的表达，以β肌动蛋白(β-actin)为内参基因。使用Primer Express 软件(Applied Biosystems,USA)设计定量PCR引物，并遵循至少一个引物跨不同外显子从而避免基因组DNA污染，见表1。使用目的基因不同浓度梯度(102～108拷贝)的质粒作为模板检测引物的扩增效率[6-7]。

1.2.3HepG2细胞株中基因敲降Apaf-1 取对数生长期HepG2细胞株，调整细胞密度6×105/mL，接种至6孔板，每孔4 mL，用10%胎牛血清的DMEM 培养，将构建好的Apaf-1 shRNA pCDH质粒按Lipofectamine2000说明书的方法转染到HepG2细胞中，对照组转染阴性空载质粒，每组设置3个复孔。

1.2.4转染效率 将1.2.3中培养的细胞株在36 h后放入荧光显微镜下观察，转染阳性细胞可看到荧光，阴性或者正常细胞不可见荧光。

1.2.5实时定量PCR仪检测相关基因表达量及抑制效率 将1.2.3中培养的细胞株在48 h后收集，按照常规方法提取细胞总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，β-actin为内参基因进行实时定量PCR反应检测细胞周期蛋白A(Cyclin A)、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)、减数分裂相关蛋白(p-CDK2)、β-catenin、APC、p-STAT3、p-STAT5、STAT3、STAT5、PRR11基因的表达。

1.2.6Wstern blot检测相关蛋白的表达量 将1.2.2中培养的细胞株在48 h后收集，按照常规方法提取细胞内总蛋白，用紫外分光光度计测定吸光值分析总蛋白纯度，稀释各组蛋白的浓度至终浓度一致，每组取50 μg蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封闭2 h，加一抗，室温孵育4 h，滴加二抗，室温孵育2 h，利用化学发光凝胶成像仪进行成像[8]。

2 结 果

2.1Apaf-1可抑制wnt/β-catenin介导的信号通路 用Super 8×TOPFlash报告因子研究Apaf-1对β-catenin介导的经典wnt信号通路的调控作用。结果发现Apaf-1可以抑制β-catenin激活的LEF荧光素酶活性，并且这种作用具有剂量依赖效应，见图1。

A：TOPFlash荧光素酶表达结果；B：TOPFlash荧光素酶剂量效应结果；a：P<0.05

图1 TopFlash-荧光素酶报告实验

2.2各细胞株中Apaf-1的表达 Apaf-1在正常的肝细胞株LO2的表达量明显高于肝癌细胞株中的表达量，且在HepG2细胞株中的表达量最低，说明HepG2细胞株对Apaf-1的更敏感，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

a：P<0.05

图2定量PCR检测Apaf-1在不同细胞株中的表达

2.3基因敲降转染效率 在RNA干扰的HepG2细胞株中，与对照组相比，实验组可以观察到明显的荧光信号，且荧光信号较多，而对照组无明显荧光信号，见图3。

A、C实验组；B、D对照组

图3根据同一视野下标记有荧光信号细胞的多少计算转染效率(×100)

2.4Real-timePCR检测相关基因的表达 在RNA干扰Apaf-1的HepG2细胞株中，与正常的HepG2细胞株相比，Apaf-1的表达量降低，说明在HepG2细胞中，Apaf-1敲降成功，同时wnt/β-catenin信号通路的相关基因或者肝癌相关基因的表达显著升高或者降低，如β-catenin、Cyclin A、CDK2、wnt5a、STAT3、EGFR、APC(P<0.05)，见图4。

siRNA：在HepG2细胞株中敲降Apaf-1基因；a：P<0.05

图4定量PCR分析在HepG2细胞株中敲降Apaf-1基因后相关基因表达量变化

2.5Wstern blot检测相关蛋白表达 在RNA干扰Apaf-1的的HepG2细胞株中，与正常的HepG2细胞株相比，β-catenin、Cyclin A、CDK2的表达量显著升高，Apaf-1、APC的表达量降低(P<0.05)，见图5。

siRNA：在HepG2细胞株中敲降Apaf-1基因

图5 Western blot检测HepG2和siRNA-Apaf-1 HepG2中相关蛋白的表达

3 讨 论

近年来，我国肝癌的发病率呈上升趋势，且术后复发率高，传统的辅助治疗、放化疗等治疗研究缓慢，都严重影响了肝癌患者的生存率。寻找更有效的诊断和治疗方法的首要步骤就是要了解其病理学分子机制。近年随着医学分子生物学、细胞生物学快速发展，肿瘤的治疗开始向细胞及基因水平发展[9]。越来越多研究证明，肝癌的发生与体内癌基因的过表达及抑癌基因的表达缺失相关[10]。因此，研究这些癌基因或抑癌基因的功能对于肝癌的治疗具有重要指导作用。

Apaf-1作为一种新发现的多功能结构域蛋白，它通过调控wnt/β-catenin信号通路的异常激活，促进靶基因的过度表达，影响细胞的增殖与分化，促进肿瘤的发生，因此，Apaf-1属于wnt/β-catenin信号通路的负调控因子[11-12]。本研究通过TopFlash-荧光素酶报告实验检测发现，当加入50 ng Apaf-1质粒时，荧光信号减弱，并且随着Apaf-1浓度的增加，检测到的荧光信号逐渐减弱。这些结果揭示了Apaf-1能够抑制wnt/β-catenin信号通路活性，且具有剂量依赖效应。

在Wnt介导的四种通路中经典的Rspo1/Wnt/β-catenin信号通路最受关注，因为经典信号通路在哺乳动物的发育过程中发挥着举足轻重的作用，例如器官再生、性别分化和肿瘤形成[7-8]。在正常的肝细胞中，β-catenin作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与钙黏蛋白(E-cadherin)形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞移动发挥作用，而在肝癌细胞中，β-catenin与由APC和Apaf-1组成的复合物减少，从而影响wnt/β-catenin信号通路异常，导致肝癌细胞的构像发生改变[10]。本研究利用PCR检测肝癌细胞株Apaf-1的表达明显低于正常肝细胞株，验证了Apaf-1确实可能通过wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞。

长期以来由于技术上的瓶颈，基因的研究很长一段时间大部分都停留在克隆和表达层面，功能研究比较缺乏，极大限制了对许多重要基因的功能认知。RNAi修饰技术的出现是对基因功能研究技术的突破，具有特异性强、操作简便、高效的特点[4]。构建Apaf-1表达载体转染至肝癌细胞株HepG2中，根据荧光信号确认成功在HepG2中敲降了Apaf-1基因。通过PCR和Wstern blot检测发现，敲降了Apaf-1基因后，HepG2中β-catenin积聚，引起与相关联的wnt/β-catenin信号通路的相关基因和因子的表达量改变，例如与细胞有丝分裂相关的CDK2和Cyclin A上升，wnt/β-catenin信号通路上游与β-catenin结合的靶蛋白APC的表达量下降等，从而引起wnt/β-catenin信号通路异常激活，促进了肿瘤的发生，这些结果都进一步揭示了Apaf-1可能参与调控肝癌的发生[13]。

综上所述，Apaf-1能够通过wnt/β-catenin信号通路调控肝癌细胞的生成，为进一步在动物体内研究肝癌的发生提供了一定的理论基础和依据，同时为肝癌的治疗提供了新的思路[14]。

[1]ISAYAMA H,NAKAI Y,RERKNIMITR R,et al.The Asian consensus statements on endoscopic management of walled-off necrosis part 1:epidemiology,diagnosis and treatment[J].J Gastroenterol Hepatol,2016,4(4):13394-13402.

[3]CHUNG Y J,KIM H J,PARK S H,et al.Transcriptome analysis reveals that Müllerian inhibiting substance regulates signaling pathways that contribute to endometrial carcinogenesis[J].Int J Oncol,2015,46(5):2039-2046.

[4]LI M,WANG X,JIA T,et al.Tankyrase inhibitors attenuate WNT/β-catenin signaling and inhibit growth of hepatocellular carcinoma cells[J].Oncotarget,2015,6(28):25390-25401.

[5]WU L,YANG P,LUO F,et al.R-spondin1 signaling pathway is required for both the ovarian and testicular development in a teleosts,Nile tilapia(Oreochromis niloticus)[J].Gen Comp Endocrinol,2016,4(1):177-185.

[6]WU L,WU F,LANG X,et al.Synergistic role of β-catenin1 and 2 in ovarian differentiation and maintenance of female pathway in Nile tilapia[J].Mol Cell Endocrinol,2016,15(5):33-44.

[7]GALLINA D,PALAZZO I,STEFFENSON L,et al.Wnt/β-catenin-signaling and the formation of Müller glia-derived progenitors in the chick retina[J].Dev Neurobiol,2016,76(9):983-1002.

[8]XIAO W,JIANG W,SHEN J,et al.Retinoic acid Ameliorates pancreatic fibrosis and inhibits the activation of pancreatic stellate cells in mice with experimental chronic pancreatitis via suppressing the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].PLoS One,2015,10(11):e0141462.

[9]OKABE H,KINOSHITA H,IMAI K,et al.Diverse basis of β-catenin activation in human hepatocellular carcinoma:implications in biology and prognosis[J].PLoS One,2016,11(4):e0152695.

[10]YIP L,SOSA J A.Molecular-directed treatment of differentiated thyroid cancer:advances in diagnosis and treatment[J].JAMA Surg,2016,151(7):663-670.

[11]HIRPARA J L,LOH T,NG S B,et al.Aberrant localization of apoptosis protease activating factor-1 in lipid raft sub-domains of diffuse large B cell lymphomas[J].Oncotarget,2016,7(51):83964-83975.

[12]GAO J,LU W F,DAI Z J,et al.Induction of apoptosis by total flavonoids from Scutellaria barbata,D.Don in human hepatocarcinoma MHCC97-H cells via the mitochondrial pathway[J].Tumour Biol,2014,33(3):2549-2559.

[13]PHAM H H,SEONG Y A,OH C W,et al.The herbal medicine cyperus amuricus inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells by inducing apoptosis and arrest at the G0/G1cell cycle phase[J].Int J Oncol,2016,49(5):2046-2054.

[14]PARK H J,JEON Y K,YOU D H,et al.Daidzein causes cytochrome c-mediated apoptosis via the Bcl-2 family in human hepatic cancer cells[J].Food Chem Toxicol,2013,60(10):542-549.