结直肠癌患者循环肿瘤DNA定量KRAS基因突变的检测

吴兆明，刘 平，余玲玲，王金丹，Nguelemo Mayopa Kevin，骆美辰，施苏雪，郑晓群,*

(1.温州医科大学； 2.温州医科大学附属第二医院， 浙江 温州 325000)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在国内恶性肿瘤中均排第5位[1]。随着表皮生长因子受体抑制剂如西妥昔单抗等靶向药物的出现，结直肠癌患者的治疗有效率和总生存时间不断提高。研究显示，西妥昔单抗的治疗效果与患者KRAS基因型密切相关，只有野生型KRAS基因的患者才能从该药物的治疗中获益，而突变型的患者则不能[2]。中国结直肠癌患者KRAS基因突变率约占30%～60%[3- 4]，主要为G12D、G12V和G13D突变等。近年来，循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)等液体活检材料在临床肿瘤研究中备受重视[5- 6]。微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR) 技术作为第3代PCR技术因其高度灵敏性而备受临床诊断领域所瞩目[7]。ddPCR能定量检测含量极低核酸分子[8- 9]，它克服了血浆ctDNA因含量低而不易扩增的难点。因此，本研究以KRAS基因G12D位点研究靶点，构建ddPCR定量检测血浆KRAS基因突变检测方法，为结直肠癌患者的早期筛查、预后判断、指导临床用药及肿瘤的转移与复发监测提供准确和便捷的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试者选择选取：2015年3月至2016年4月在温州医科大学附属第二医院的结直肠癌患者为研究对象。患者经病理组织学确诊，同时符合2010 年中国卫生部制定的《结直肠癌诊疗规范》中的诊断标准。本研究共52例患者，男性29例，女性23例，年龄中位数45岁(35～82岁)。选择同期正常健康体检人群为对照组，共80名，男性45名，女性35名，年龄中位数38岁(25～81岁)，对照人员无肿瘤病史、无高血压、糖尿病及高脂血症等慢性病，无严重器质性心、肝、肺等病史，妊娠期及哺乳期妇女除外。参加此项课题的受试群体均无血缘关系，且经医院伦理委员会批准，受试者签订知情同意书。

1.1.2 试剂：血清/血浆游离DNA提取试剂盒(金麦格生物技术有限公司)；人类组织DNA试剂盒(Qiagen公司)；Bio-RadQX100TMddPCRTM定量试剂盒(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 采集标本和临床资料：收集4 mL外周血于EDTA-K2抗凝管，1 600×g10 min，16 000×g10 min低温分离血浆，将血浆置于-80 ℃冰箱冷冻保存。同时，采取结直肠癌患者肿瘤组织标本，置于-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 ddPCR技术检出限检测：由上海奕跃生物科技有限公司人工合成124 bp的KRAS基因目的片段克隆于pUC- 57质粒载体，将质粒作为野生型和突变型标准品。将突变型标准品按10倍比稀释为8.436×105copies/μL到8.436×10-1copies/μL标准品，质粒浓度初始浓度计算公式：(6.02×1023)×10-9(ng/μL)/(DNA length×660)=copies/μL，每个浓度的样本重复检测3次，以此评估ddPCR的检出限。

1.2.3 ddPCR检测ctDNA的KRAS基因型：按DNA提取试剂盒提取游离DNA，上游引物序列：TG GTCTGTTTTGCTTGGTCAAG，下游引物序列：GCTG TCTACACTCAACTAGCAAGGAA；探针：HEX-GAGC TGGTGGCGT和FAM-GAGCTGATGGCGT；PCR反应体系：2×ddPCR 探针反应混合液12.5 μL，10 μmol/L引物每条各2.25 μL，10 μmol/L探针每条各0.675 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足至25 μL。野生型与突变型质粒分别作为野生型标准品和突变型标准品，用于阳性及阴性对照，以保证结果的准确性。

1.2.4 Sanger测序检测肿瘤组织的KRAS基因型：采用DNA试剂盒对新鲜组织样本进行DNA提取，NanoDrop 2000超微量分光光度计测定样本DNA含量与纯度。15 μL PCR反应体系中包含:7.5 μL 2×Taq Plus Master mix， 0.2 μL上下游引物和2 μL DNA样本，ddH2O补足至15 μL；PCR反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 12 min。扩增产物送杭州华大基因公司在ABI3730序列分析仪上进行双向测序，测序结果采用Chroms软件进行分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0和Graph Pad PrismV5.0 统计学软件进行数据分析，人均年龄描述位(中位数，最小值-最大值)，KRAS基因突变检出率组间比较采用卡方检验，KRAS基因G12D突变浓度组间比较采用Mann-Whitney 检验。

2 结果

2.1 稀释实验评价ddPCR检测限

ddPCR技术对质粒KRAS基因的检测限可达8.436 copies/μL，较Taqman荧光定量技术高1个数量级(表1)。

2.2 ddPCR检测KRAS基因G12D突变率

患者组血浆KRAS基因G12D突变率达26.92%，显著高于健康对照的8.75%(P<0.05)(图1)。高度分化腺癌的突变率为77.78%，显著高于中度和低度分化腺癌的突变率(P<0.05)；淋巴结转移N2的突变率为46.15%，显著高于N0和N1(P<0.05)(表2)。

2.3 ddPCR检测KRAS基因G12D突变浓度

结直肠癌患者组14例KRAS基因G12D突变型携带者中血浆突变浓度中位数为81.5 copies/mL(10～2 586 copies/mL)显著高于健康对照7名携带者的16 copies/mL(7.5～23 copies/mL)(P<0.000 1)。患者组淋巴转移N2患者突变浓度中位数120 copies/mL(12～2 586 copies/mL)显著高于N1和N0患者(P<0.05)(表2)。

表1 ddPCR技术和Taqman荧光定量技术突变基因检测限的比较

2.4 结直肠患者血浆ctDNA和肿瘤组织KRAS基因突变检测结果的比较

52例中16例存在KRAS基因G12D突变，其中血浆样本检测出14例存在KRAS基因G12D突变。

blue droplets forKRASgene wild type；green droplets forKRASgene Mutant type；A03.blank group；B03.wild typeKRASgene negative control；C03.mutantKRASgene positive control；D03-H03.sample 1～5；A03.blank group；B03.wild typeKRASgene negative control；C03.mutantKRASgene positive control；D03-H03.sample 1～5

图1 KRAS基因G12D突变的ddPCR分析结果一维散点图和微滴结果图Fig 1 One dimensional scatter plot of ddPCR analysis results and drop result diagram of KRAS gene G12D mutation

且14例血浆和组织标本中的突变一致，以组织样本KRAS基因Sanger测序结果为金标准， ddPCR检测血浆ctDNA中KRAS基因G12D突变特异性为87.50%(表3)。

表3 52例结直肠癌患者血浆ctDNA和肿瘤组织KRAS基因G12D突变结果比较

3 讨论

表皮生长因子受体抑制剂西妥昔单抗是治疗结直肠癌的靶向药物，它使结直肠癌的治疗进入了个体化靶向治疗时代，在临床取得了很好的治疗效果。研究显示，西妥昔单抗治疗的有效性受患者下游基因KRAS状态的影响。只有野生型KRAS基因的患者才能从西妥昔单抗的治疗中获益，而突变型的患者则不能[10- 11]。因此，本文通过建立ddPRC技术定量检测KRAS基因G12D突变，为临床用药提供指导。在52例结直肠癌患者的血浆样本中共检出了14例KRAS基因G12D突变，占26.92%，本研究结果与报道[12]的检测860例中国结直肠癌患者肿瘤组织中16.5%KRAS基因G12D突变结果以及报道[13]的21.49%相一致；进一步分析发现血浆KRAS基因G12D突变率与分化程度和淋巴结转移等临床特征相关，血浆KRAS基因G12D突变浓度与淋巴结转移相关。这可能与肿瘤的局部扩散，淋巴结转移个数增加而导致肿瘤细胞主动释放ctDNA增加有关。另外，该技术对质粒KRAS基因的检测限可达8.436 copies/μL，较Taqman荧光定量技术高1个数量级。同时，结直肠癌患者血浆KRAS基因G12D突变与肿瘤组织突变一致性达87.50%，但由于血浆ctDNA含量较少，可能存在假阴性结果，本研究发现2例血浆ctDNA未检出G12D突变。正如Sanmamed、Oxnard等[14- 15]相关报道ddPCR技术可应用于ctDNA突变检测。因此，本项目研究应用ddPCR高敏感、高特异性的技术优势建立的KRAS基因突变定量检测方法，以血浆ctDNA为检测对象，可以实时为结直肠癌患者提供体内肿瘤特异基因改变的信息，并进一步为其以靶向治疗为基础的个体化治疗用药、预后判断等提供准确和便捷的实验室依据。

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