氨氮对中华鳑鲏的急性毒性及2种代谢酶活性的影响

封 琦，朱光来，王建国，齐富刚，熊良伟，王 权

(江苏农牧科技职业学院水产科技学院，江苏泰州 225300)

中华鳑鲏(Rhodeussinensis)是鲤形目鲤科鳑鲏属的一种小型底栖型鱼类，不仅具有很高的观赏价值，而且在养殖实践中还可用作“生态鱼”，对水体环境起到指示预警作用[1]。氨氮作为养殖水体中重要的环境因子，一直是水质监测的重要指标之一。氨氮主要来自于水体中的外源有机物分解以及水生动物自身的内源排泄物[2]。氨氮不仅会对鱼类的鳃表皮细胞造成损害，从而影响呼吸作用；还会对肝肾组织造成破坏，并导致非特异性免疫抑制效应[3-4]。目前有关氨氮对鱼类作用的研究主要集中在两方面，一方面侧重于从环境污染评估角度寻找分子标记物[3,5]；另一方面则从免疫、代谢角度研究氨氮毒性作用机理[6-8]。研究对象则主要以斑马鱼等模式生物以及主要养殖商品鱼类为主[4-5,9-15]。氨氮对中华鳑鲏的作用影响则未见相关报道。已有研究表明氨氮长期暴露会对鱼类的免疫能力，抗应激能力造成抑制作用[16-17]。碱性磷酸酶(Alkalinephosphates，AKP)是一种常见的免疫标志酶[18]。李波等[19]发现在慢性氨氮胁迫下，黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)血液中AKP酶活性升高较快。过氧化氢酶(Catalyse，CAT)是生物抗氧化系统的重要组成部分，在生物毒性评价中有重要意义。Sinha等[20]认为常见鲤科鱼类(锦鲤Cyprinuscarpio和金鱼Carassiusauratus)在遇到氨氮刺激时，肝脏中的CAT将组成抗氧化应激的首道防线，对机体起保护作用。本研究以氯化铵模拟水体中氨氮，研究了氨氮对中华鳑鲏急性毒性，并根据急性毒性结果进一步探明了氨氮胁迫下中华鳑鲏血清中过氧化氢酶(CAT)和碱性磷酸酶(AKP)的响应变化，为中华鳑鲏健康养殖中的水质管理提供科学建议。

1 材料与方法

1.1 实验材料

中华鳑鲏购自江苏农牧科技职业学院启航水族店，试验前在1.0 m×0.6 m×0.5 m的水族缸中暂养两周。暂养期间，正常投喂配合饲料，每天清除排泄物，水温维持在(25±1)℃，pH为7.4±0.1。挑选健康、活泼的个体(体重(0.628±0.006)g，体长(3.989±0.290)cm用于试验。

测定酶活性所用的试剂盒(CAT、AKP)均购自南京建成生物科技有限公司,NH4Cl及其他药品均为国产分析纯。

1.2 实验设计

急性毒性试验采用静水法，根据预实验，设置6个浓度组200、230、260、290、320、360 mg/L和1个空白对照，每组3个平行。不同浓度的测试液采用0.01 mol/L磷酸缓冲液(维持pH 7.4左右)添加适量NH4Cl制备成，每组水量10 L。每个浓度组随机加入20尾活力良好的中华鳑鲏，24 h后计数死亡个体数。

在急性毒性试验的基础上，按1/10、1/20、1/30 LC50设置高、中、低3个处理组，每组处理3个平行；每个处理组20条鱼，其余试验条件同急性毒性测试；分别于0、24、48、72 h随机取出5尾，采用1 mL无菌注射器围心腔取血，合并置于无菌离心管中，3 500 r/min离心10 min，取上层血清，立即测定CAT、AKP酶活性，测定方法参照试剂盒说明书。

1.3 数据分析

急性毒性数据采用概率单位法分析，为检验氨氮高、中、低浓度对CAT和SOD酶活性的时间变化影响，采用双因素方差(two-way ANOVA)进行数据分析(固定因子为氨氮浓度和暴露时间)。方差分析之前,检验样本数据是否满足正态性(Shpiro-Wilk)及方差齐性(Levene’s test)。如果数据方差不齐,则进行数据转换使之满足方差齐性。交互作用显著时,通过MANOVA语句分别检验氨氮浓度或暴露时间处理在另一因素不同水平上的简单效应[21-22]；交互作用不显著时，分析氨氮浓度和暴露时间的主效应，并采用Bonferroni法进行事后多重比较，所有计算均采用统计软件SPSS 24.0完成。

2 结果

2.1 氨氮对中华鳑鲏的急性毒性作用

中华鳑鲏放入测试液中不久，就观察到高浓度组320、360 mg/L中出现上浮现象，3 h后鱼体失去平衡，12 h后出现体表充血、死亡现象，急性毒性实验结果见表1。采用概率单位法计算得到氨氮对中华鳑鲏24 h LC50(95%置信区间)为263.28 mg/L(200.97～344.93 mg/L)；毒力回归方程为：y=-24.404 4+12.148 5x，r=0.945 2。

表1 氨氮对中华鳑鲏的急性毒性效应

2.2 氨氮对中华鳑鲏血清CAT活性的影响

由表2可知，高中低三个剂量组中CAT酶活性均随着暴露时间延长呈现下降趋势，由图1可见，每个时间点的CAT酶活性随着氨氮剂量增高呈现先上升后下降的趋势。双因素方差分析表明：氨氮浓度和暴露时间均会对CAT酶活性造成显著影响，其中暴露时间对CAT酶活性影响作用极显著，并且两因素之间存在显著的交互作用(见表3)。简单效应检验结果显示暴露时间对CAT酶活性的作用受到不同氨氮浓度的影响(MANOVA,9 mg/L:F3,26=15.06，P<0.01；13 mg/L，F3,26=12.23，P<0.01；26 mg/L，F3,26=30.08，P<0.01)。

图1 氨氮浓度对中华鳑鲏血清CAT酶活性的作用影响

表2 不同暴露时间对中华鳑鲏血清CAT酶活性的影响

表3 氨氮和暴露时间对中华鳑鲏血清CAT酶活性的双因素方差分析

注：加粗数字表明差异显著P<0.05。表5同。

2.3 氨氮对中华鳑鲏血清AKP酶活性的影响

由表4可知，低剂量组中AKP酶活性均随着暴露时间延长呈现先上升后下降趋势，在中、高剂量组则呈现随时间下降趋势。由图2可见，每个时间点的AKP酶活性随着氨氮剂量增高呈现下降的趋势。双因素方差分析表明：氨氮浓度和暴露时间均会对AKP酶活性影响极显著，并且两因素之间存在极显著的交互作用(见表5)。MANOVA检验结果显示氨氮浓度在暴露时间24 h和48 h两个水平上简单效应极显著(24 h:F3,27=7.80，P<0.01；48 h，F3,27=15.24，P<0.01)；暴露时间在氨氮浓度9 mg/L水平上简单效应极显著(F3,26=9.42，P<0.01)。

图2 氨氮浓度对中华鳑鲏血清AKP酶活性的作用影响

表4不同暴露时间对中华鳑鲏血清AKP酶活性的影响

Tab.4EffectsofexposuretimeonactivityofAKPinserumofR.sinensis(x±s,n=3)

金氏单位/100 mL

表5 氨氮和暴露时间对中华鳑鲏血清AKP酶活性的双因素方差分析

3 讨论

3.1 氨氮对中华鳑鲏的急性毒性

氨氮普遍存在于水体环境中，其主要来源于农业生产废水排放以及生物废弃物降解。氨氮对所有脊椎动物均有毒性作用，会造成痉挛、昏迷以及死亡等症状[23]。水环境中高浓度的氨氮会对鱼类产生氧化应激作用，造成肝组织病理变化及细胞凋亡[24]；还会对红细胞产生明显的遗传毒性作用[6]。

本研究发现在水温25 ℃，pH 7.4的条件下，中华鳑鲏对氨氮有较强的耐受性。氨氮对中华鳑鲏的24 h LC50(263.28 mg/L)要高于此前报道的斑马鱼(126 mg/L)[25]、青鱼幼鱼(Mylopharyngodonpiceus)(80.98 mg/L)[13]、团头鲂幼鱼(Megalobramaamblycephala)(65.277 mg/L)[4]、白斑狗鱼幼鱼(Esoxlucius)(34.36 mg/L)[9]以及鳜(Megalobramaamblycepha(a))(35.51 mg/L)[26]。氨氮对水生生物的毒性主要受到水体温度、pH、离子强度的影响；尤其pH对其毒性效应影响显著(酸性时毒性降低，碱性时毒性变强)。本试验所采用的温度和pH条件参考了此前研究报道，排除了主要外在因素的干扰，试验结果具有一定的可比性。研究表明鱼类可以采用某些生理代谢机制，保护自身免受外界环境中的氨氮刺激：有许多硬骨鱼类在高浓度氨氮环境中，脑部能够主动激活谷氨酰胺合成，再释放到血液中，作为无毒载体将氨氮从不同组织运送到肝脏中进行代谢[27-28]；还有有些鱼类在受到氨氮胁迫时，可以通过降低蛋白以及氨基酸水解速率以减缓氨氮产生，从而降低氨氮毒性[23]。王建国等[29]研究发现中华鳑鲏的排氨率远低于沙塘鳢等鱼，因此中华鳑鲏可能主要依靠上述机制来减少氨氮毒性。此外Clifford等[30-31]以一种深海“清道夫”—太平洋八目鳗(Eptatretusstoutii)为研究对象，对其氨氮耐受性进行了研究，他们认为鱼类中普遍存在的一类NH4+转运蛋白Rhesus (Rh)糖蛋白在氨氮排泄中起着十分重要的作用。中华鳑鲏生活在水体中下层、能摄食腐肉等生态特征与太平洋八目鳗等高氨氮耐受性鱼类相近，因此中华鳑鲏也可能存在相似生理机制来抵御氨氮刺激。

3.2 统计方法比较

此前的报道中多采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较的方法对不同浓度组和时间点的数据进行统计分析，均发现时间对氨氮毒性有一定影响，但并未对暴露时间和浓度的交互作用进行验证[5,19,32-34]。本研究中采用双因素方差分析方法，对两者的交互作用进行了详细检验，发现暴露时间和浓度对CAT和AKP的酶活性均存在交互作用；并且采用MANOVA语句对各因子不同水平上的简单效应进行了分析，规避了此前的统计分析漏洞。

3.3 氨氮对CAT酶活性的作用

已有报道表明养殖水体中的氨氮会对鱼类的血清抗氧化系统造成损害[35]。CAT作为鱼体中一类重要的抗氧化酶类，常被用作生物标志物，可用来预测环境中的氨氮污染[25,32,36]。本研究发现在氨氮胁迫下，CAT酶活性随着暴露时间延长总体呈下降趋势，并且在同一时间点会随着氨氮剂量增高呈现先上升后下降的趋势；该现象与韩力强[37]、许星鸿等[25]的观察结果一致。这说明氨氮对CAT具有抑制作用；在低浓度范围内随着氨氮浓度增加，CAT酶活性随之增加以维持体内氧化还原平衡，当氨氮超过一定浓度范围后，将对机体造成损伤，从而导致酶活性下降。此外，统计分析结果表明CAT酶活性受到浓度和暴露时间二者的显著影响，这说明氨氮对中华鳑鲏的毒性效应与浓度和暴露时间密切相关，与其余报道的研究结论相一致[6,10,14]。

3.4 氨氮对AKP酶活性的影响

AKP是一种参与磷代谢的水解酶，常被用作免疫学指标监测环境污染[38-40]。艾春香等[41]研究发现拟穴青蟹AKP对氨氮胁迫比较敏感。在氨氮胁迫初始阶段，低剂量组中AKP酶活性呈上升趋势，而在中高浓度组呈下降趋势。这说明在低浓度氨氮胁迫下，机体能够主动产生应激反应以提高AKP酶活性；当氨氮浓度高于9 mg/L时，将超过机体调节范围，并对AKP产生抑制作用。另外，随着暴露时间延长，AKP最终呈下降趋势，这说明随着暴露时间延长氨氮会对AKP酶活性产生抑制作用，破坏鱼体免疫力，从而引起病害发生。

[1]赵朝阳,姜彦钟,方秀珍,等.鳑鲏的生物学特性及观赏价值[J].生物学通报,2010,45(4):7-9.

[2]邓小洪,顾建峰,王玉群.水产动物氨氮中毒症状和解毒[J].科学养鱼,2014,30(10):88.

[3]李利红,袁宏利,胡振平,等.氨氮对福瑞鲤鳃和肝组织抗氧化能力的影响[J].安徽农业科学,2015,43(22):96-98.

[4]张武肖,孙盛明,戈贤平,等.急性氨氮胁迫及毒后恢复对团头鲂幼鱼鳃、肝和肾组织结构的影响[J].水产学报,2015,39(2):233-244.

[5]周 莹,孙梨宗,刘志红,等.氨氮对斑马鱼3种酶活性和基因表达的影响[J].沈阳师范大学学报(自然科学版),2016,34(1):88-91.

[6]姜会民.氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼红细胞微核、核异常的影响[J].四川动物,2011,30(5):768-771.

[7]姜会民.分子氨对黄河鲤非特异性免疫的影响[J].西南大学学报(自然科学版),2013,35(9):55-58.

[8]姜会民.氨氮对黄河鲤蛋白酶活性的影响[J].动物医学进展,2013,34(9):79-81.

[9]胡萍华,金一春,曲学伟,等.氨氮对白斑狗鱼成鱼的急性毒性研究[J].湖南农业科学,2010,(3):109-111.

[10]阮成旭,袁重桂,吴德峰,等.氨氮和亚硝态氮对大黄鱼幼鱼的急性毒性效应[J].福州大学学报(自然科学版),2014,42(2):333-336.

[11]刘 娥.草幼鱼对氨氮胁迫的形态及生理学响应[D].山东济南:山东大学,2013.

[12]龚 全,赵 刚,王 婷,等.铵态氮和亚硝酸盐氮对岩原鲤的急性毒性试验[J].西南农业学报,2010,23(1):231-233.

[13]李昭林,黄 云,田芊芊,等.氨氮对青鱼幼鱼的急性毒性研究[J].科学养鱼,2013,31(5):52-53.

[14]鲁增辉,王志坚,石 蕊.氨氮对稀有鮈鲫胚胎和幼鱼的急性毒性研究[J].西南大学学报(自然科学版),2014,36(1):47-52.

[15]杨晶晶,孟祥科,王 鑫,等.非离子氨对红鳍东方鲀的急性毒性研究[J].现代农业科技,2013,(6):253-254.

[16]徐 杨,肖 炜,李大宇,等.慢性氨氮胁迫对尼罗罗非鱼幼鱼生长及生理功能的影响[J].南方农业学报,2015,46(2):327-331.

[17]陈家长,臧学磊,胡庚东,等.氨氮胁迫下罗非鱼(GIFTOreochromisniloticus)机体免疫力的变化及其对海豚链球菌易感性的影响[J].生态环境学报,2011,20(4):629-634.

[18]李 赫,宋文华,于 翔,等.几种免疫增强剂对草鱼SOD、CAT及AKP活性的影响[J].水产学杂志,2010,23(4):6-9.

[19]李 波,樊启学,杨 凯,等.慢性氨氮胁迫对黄颡鱼摄食、生长及血液指标的影响[J].应用与环境生物学报,2011,17(6):824-828.

[20]Sinha A K,Abdelgawad H,Giblen T,et al.Anti-oxidative defences are modulated differentially in three freshwater teleosts in response to ammonia-induced oxidative stress.[J].Plos One,2014,9(4):e95319.

[21]龚学臣.SPSS软件在交互效应方差分析中的应用[J].河北北方学院学报(自然科学版),2015,31(1):19-22.

[22]王春枝.多元方差分析及其在SPSS软件中的实现[J].现代计算机,2013,(13):59-62.

[23]Randall D J,Tsui T K N.Ammonia toxicity in fish[J].Mar Pollut Bull,2002,45(1):17-23.

[24]Jin J,Wang Y,Wu Z,et al.Transcriptomic analysis of liver from grass carp (CtenopharyngodonIdellus) exposed to high environmental ammonia reveals the activation of antioxidant and apoptosis pathways[J].Fish Shellfish Immunol,2017,63:444-451.

[25]韩力强,康现江,李双石,等.氨氮对斑马鱼2种代谢酶类的影响[J].河北大学学报(自然科学版),2005,25(2):179-184.

[26]郭丰红,汪之和,陈必文,等.分子氨和亚硝态氮对鳜成鱼的急性毒性试验[J].食品科学,2009,30(23):397-400.

[27]Suarez I,Bodega G,Fernandez B.Glutamine synthetase in brain:effect of ammonia[J].Neurochem Int,2002,41(2):123-142.

[28]Sinha A K,Giblen T,Abdelgawad H,et al.Regulation of amino acid metabolism as a defensive strategy in the brain of three freshwater teleosts in response to high environmental ammonia exposure.[J].Aquat Toxicol,2013,s130-131(2):86-96.

[29]王建国,王 权,封 琦,等.溶氧胁迫下中华鳑鲏的呼吸和氮代谢生理研究[J].上海海洋大学学报,2016,25(2):183-188.

[31]Clifford A M,Weinrauch A M,Edwards S L,et al.Flexible ammonia handling strategies using both cutaneous and branchial epithelia in the highly ammonia tolerant pacific hagfish.[J].Am J Physiol-regul,Integr Comp Physiol,2017,31(2):78-90.

[32]胡 毅,黄 云,钟 蕾,等.氨氮胁迫对青鱼幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶、组织结构及血清部分生理生化指标的影响[J].水产学报,2012,36(4):538-545.

[33]肖 炜,李大宇,徐 杨,等.慢性氨氮胁迫对吉富罗非鱼幼鱼生长、免疫及代谢的影响[J].南方水产科学,2015,(4):81-87.

[34]韩春艳,郑清梅,陈桂丹,等.氨氮胁迫对奥尼罗非鱼非特异性免疫的影响[J].南方水产科学,2014,10(3):47-52.

[35]张红梅,姜会民.分子氨对黄河鲤鱼血清抗氧化反应的影响[J].西南大学学报(自然科学版),2011,33(8):88-93.

[36]强 俊,徐 跑,何 杰,等.氨氮与拥挤胁迫对吉富品系尼罗罗非鱼幼鱼生长和肝脏抗氧化指标的联合影响[J].水产学报,2011,35(12):1837-1848.

[37]许星鸿,张雁秋,阎斌伦,等.氨氮胁迫对日本蟳免疫生理指标及器官结构的影响[J].生态学报,2014,34(14):3885-3894.

[38]刘存岐,王安利,王维娜.海水中Zn2+和Mn2+对日本对虾仔虾体内碱性磷酸酶活性的影响[J].水产科技情报,2002,29(5):195-197.

[39]吴志昊,尤 锋,王英芳,等.水中亚铁对大菱鲆幼鱼红细胞核异常及碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J].海洋湖沼通报,2011,(4):45-51.

[40]王 卓,么宗利,林听听,等.碳酸盐碱度对青海湖裸鲤幼鱼肝和肾SOD、ACP和AKP酶活性的影响[J].中国水产科学,2013,20(6):1212-1218.

[41]艾春香,曾媛媛.氨氮胁迫对拟穴青蟹腺苷三磷酸酶和磷酸酶比活力的影响[J].厦门大学学报(自然科学版),2011,50(4):772-778.