草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

汤亚方，曾伟伟，王 庆，王英英，石存斌，冯 茹，高 辉，王承宝

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌，712100；2.农业部渔药创制重点实验室， 广东省水产动物免疫重点实验室，中国水产科学院珠江水产研究所，广州，510380)

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)致病力强，传播速度快，感染该病毒而导致的草鱼出血病(grass carp hemorrhage disease，GCHD)发病季节长、流行范围广、死亡率高，严重危害我国草鱼养殖业的健康发展[1-3]。草鱼的天然免疫在抵挡病毒等入侵方面发挥着重要作用，其体内的模式识别受体主要分为4类：Toll样受体(TLRs)、维甲酸诱导基因(RIG)I样受体(RLRs)、NOD样受体(NLRs)、C型凝集素受体(CLRs)，这四种模式识别受体在体内通过不同信号传导途径在机体内产生级联放大效应，刺激机体产生抗病毒免疫反应。过去几十年里，通过对病原体的识别、致病规律、硬骨鱼类抗病毒免疫网络机制的研究等方面逐渐深入，草鱼出血病的预防措施正在不断完善和加强[4]。GCRV基因组由11个分节段的dsRNA组成，编码7种结构性多肽(VP1-VP7)，5种非结构性多肽(NS1-NS5)[5,6]。由于病毒基因组分节段，使得不同毒株之间可以发生重配而产生高度变异的新株型，目前已知的GCRV有40多个分离株，其中部分已完成基因组测序[7]，关于GCRV基因组的分型目前尚未形成统一的标准，但普遍共识是我国流行的GCRV毒株分为至少I、Ⅱ、Ⅲ型[2,8-10]三种基因型。近几年我国草鱼出血病病原调查分析表明，当前我国的草鱼出血病呈现出不同基因型病毒单独感染和混合感染的态势，其中Ⅱ型占96%以上，为当前的主要流行基因型[7]。

生物信息学分析表明，GCRVⅡ型毒株S9基因节段编码一个长达418 aa的蛋白质(VP6)，分子质量约为42.86 ku[11]；GCRVⅡ型毒株S9基因编码核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均96%以上。Fang等[5]的研究表明，VP6蛋白参与GCRV病毒粒子内衣壳蛋白的构成，能连接内衣壳和外衣壳，因此推测GCRVⅡ型 S9基因编码的蛋白为一种结构蛋白。本实验选取GCRVⅡ型代表毒株GCRV-HZ08株，PCR扩增S9基因片段、构建原核表达载体诱导VP6蛋白表达，蛋白纯化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体，并采用Western blot和间接免疫荧光试验初步分析制备的多克隆抗体的免疫学特性，意在为GCRVⅡ型病毒S9基因节段编码蛋白的功能研究、GCRV Ⅱ型病原学特性研究以及草鱼出血病的临床诊断和防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

GCRV GZ1208、HZ08、HuNan1307株，鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)，锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)，大嘴鲈鱼病毒(large-mouth Bass virus,LMBV)，传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)均由珠江水产研究所鱼病室分离并保存；HGDRV株由中国水产科学研究院长江水产研究所惠赠；草鱼鱼鳔上皮细胞(GSB)、鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)、锦鲤尾鳍细胞(KF)均由本实验室保存；M199培养基、胎牛血清(FBS)，大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α)感受态、大肠杆菌BL21(DE3)(E.coliBL21)感受态，PCR试剂盒，BamHⅠ酶、XholI酶，T4 Ligase和质粒提取试剂盒等均购自TaKaRa公司(中国大连)；胶回收试剂盒购自Omega公司(美国)；pET-32a(+)质粒由本实验室保存；SDS-PAGE试剂盒、DAB显色试剂盒等购自康为世纪有限公司(中国北京)。

1.2 实验动物

体重约1.5～2.0 kg的雌性新西兰兔3只，购自广东省医学实验动物中心。

1.3 PCR扩增S9基因

根据GenBank(GU350746.1；HQ231205.1；KM 880073.1；KR180376.1；KU254574.1； KF712483.1；KC847328.1；KC201185.1)中GCRV Ⅱ型S9基因保守区域序列设计1对引物，上游引物：5′-GAT GGA TCC ATA GTC TCG GAA GCC TAC CAA-3′；下游引物：5′-ATA CTC GAG AGC ACG CGT CCA GTT ATT-3′(下划线序列分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点)。每25 μL反应体系中加入2.5 μL 10×PCR reaction buffer，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物分别为0.5 μL，2 μL GCRV-HZ08株cDNA作为模版，LA Taq酶0.25 μL，ddH2O 18.75 μL；PCR反应按如下程序进行：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.4 构建pET-32a-S9原核表达载体

用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对PCR扩增的S9片段和表达载体pET-32a(+)进行双酶切处理，37 ℃反应2 h，回收酶切后的目的片段和载体片段并连接，连接反应体系为T4 Ligase 1.5 μL，T4 Ligase buffer 1.5 μL，pET-32a(+)载体 5 μL，S9目的片段8 μL，16 ℃反应4 h。取E.coliDH5α将连接产物转化入其中，提取重组质粒，经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后，送样至广州艾基生物技术有限公司进行测序验证，经验证正确的重组载体定名为pET-32a-S9。

1.5 VP6蛋白的诱导表达及表达形式分析

将上述鉴定正确的pET-32a-S9重组质粒转化至E.coilBL21(DE3)中，筛选的阳性菌落挑至LB/Amp液体培养基置于恒温摇床中扩大培养，测定光密度为(A600 nm=0.6)时，加入IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导。诱导结束后收集菌体，超声波(工作5 s，间歇10 s，功率250 W)裂解菌体，裂解菌体时注意保持低温环境，收集破碎后的上清和沉淀，将上清和沉淀分别标记为溶液A、溶液B。SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况和表达形式，同时设立空载体pET-32a(+)作为阴性对照。

1.6 优化IPTG诱导条件

最优诱导表达条件采用棋盘法进行筛选。重组质粒pET-32a-S9转化至E.coliBL21(DE3)后，挑取筛选的阳性克隆至LB/Amp液体培养基中，恒温摇床上(200 r/min、37 ℃)培养12 h。在3 mL LB/Amp培养基中加入30 μL上述菌液，恒温摇床(转速、温度同上)上继续培养，至光密度(A600 nm分别设为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0，以实际测定为准)，分别加入IPTG(IPTG终浓度设为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)诱导，继续在恒温摇床(转速、温度同上)中培养10 h，离心收集菌体，对重组目的蛋白的相对表达量进行分析。

1.7 目的蛋白纯化

上述可溶性分析显示重组蛋白为包涵体蛋白，棋盘法筛选最佳诱导条件为，在OD600 nm约为1.0，IPTG终浓度为1.6 mmol/L时，目的蛋白的表达量最高，可达70%以上。在最优诱导条件下将导入重组质粒的E.coliBL21(DE3)大量诱导表达，离心收集菌体，再加入PBS重悬，在冰上超声波(工作5 s，间歇10 s，功率250 W)破碎菌体至溶液澄清。将破碎液离心，收集沉淀，按Ni-凝胶纯化试剂盒(包涵体蛋白纯化)说明书的步骤纯化表达的重组VP6蛋白，收集洗脱液，保存备用。

1.8 多克隆抗体的制备

选取3只2月龄，质量为1.5～2.0 kg左右的健康雄性新西兰兔，其中1只每次注射等量生理盐水为阴性对照。每次将纯化的重组蛋白经无菌生理盐水稀释后与佐剂按1∶1比例乳化，免疫方法为背部皮下多点注射，每只注射2 mL(抗原含量200 μg)，初次免疫使用完全弗氏佐剂，之后均使用弗氏不完全佐剂。第0周、第2周、第4周、第6周各免疫一次，并于第7周进行耳缘静脉采血测定抗体效价。效价符合要求后，进行心脏采血，收集血清，-20 ℃保存备用。

1.9 间接ELISA检测血清抗体效价

将pH 9.6的碳酸盐缓冲液按1∶104稀释纯化的重组蛋白(50 ng/mL)作为包被液，包被96孔酶标板，每孔100 μL，置于4 ℃冰箱过夜；每孔滴加1% BSA 200 μL置于37 ℃封闭2 h；封闭结束后加入等梯度稀释(1∶101、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010)的血清各100 μL， 37 ℃作用2 h；然后加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)100 μL，37 ℃作用1 h；以上每步反应结束后都用PBST缓冲液洗板3～5次，每次5 min；最后用TMB显色试剂盒显色，终止显色用0.5 mol/L的H2SO4溶液。酶标仪上读取A450 nm值(当A450 nm≥0.277，且大于阴性对照2.1倍时，判定为阳性)。对照组设置相应稀释倍数的阴性血清。

1.10 Western blot分析

将纯化的VP6重组蛋白、浓缩的GCRV HZ08、GZ1208、104、KHV、ISKNV、LBMV和SCRV病毒进行SDS-PAGE电泳，将分离的蛋白通过半干转膜法转移至NC膜上，于2%的BSA封闭液中室温封闭2 h；一抗为1∶1 000稀释的上述血清，37 ℃作用2 h；二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37 ℃作用1 h；每次反应后均用TBST洗3～5次，每次5 min，最后用DAB显色剂显色并观察结果。

1.11 间接免疫荧光试验(IFA)

将GSB、EPC和KF细胞传代至96孔细胞培养板中，待细胞长至单层铺满80%左右后，GSB细胞接种GCRV-HZ08、HuNan1307、GZ1208、HGDRV病毒，EPC细胞接种ISKNV、LBMV、SCRV病毒，KF细胞接种KHV病毒，设置未接种病毒的正常细胞作为阴性对照。攻毒5 d后，吸净细胞培养板上的培养基，PBS(0.01 mol/L)洗涤3次，使用80%丙酮溶液固定，反应结束后吸净细胞培养板上的丙酮，室温下干燥；一抗为1∶1 000稀释的兔抗VP6蛋白多克隆抗体，滴加100 μL，37 ℃作用1 h，PBST洗涤3次，每次5 min；二抗为1∶50稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，滴加100 μL，37 ℃作用1 h，PBST洗涤3次，每次5 min，最后加入碘化丙啶染料，荧光倒置显微镜下观察结果。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物鉴定

1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图1)显示，在约750 bp处出现一条特异性条带，与预期大小一致，阴性对照无任何条带。

图1 PCR扩增S9基因产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of amplification result for S9 gene PCR products1.阴性对照；2.S9基因PCR产物；M.DNA Marker DL 1000

2.2 双酶切鉴定重组表达载体

使用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒pET-32a-S9进行双酶切，经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果(见图2)显示一大小约为750 bp的特异性条带；经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果显示目的片段及阅读框均正确。

2.3 VP6蛋白的表达和表达形式分析

SDS-PAGE电泳结果(见图3)显示，泳道1、2中未出现明显表达的蛋白条带，泳道4中约42 ku处出现一条明显的重组蛋白条带，与预期大小相符；泳道3中未见明显的重组蛋白条带，泳道5中重组蛋白含量较多。上清溶液A中重组蛋白含量很低，目的蛋白主要存在于溶液B中，说明目的蛋白主要以包涵体形式存在。

图2 重组质粒pET-32a-S9双酶切鉴定结果电泳图Fig.2 Electrophoretogram of digestion identification of pET-32a-S9 recombinant plasmid M.DNA Marker DL 15000；pET-S9.重组质粒 pET-32a-S9双酶切产物

图3 SDS-PAGE分析重组质粒pET-32a-S9 表达产物及其可溶性Fig.3 SDS-PAGE analysis results for the expression product of pET-32a-S9 recombinant protein and its the dissolubility of the recombinant protein M.低相对分子质量蛋白质marker；1.pET-32a(+) 空载体的诱导表达；2.pET-32a-S9重组载体未经 IPTG诱导对照；3.上清溶液A；4.pET-32a-S9 重组载体的诱导表达；5.沉淀溶液B

2.4 纯化蛋白的鉴定

与泳道3中未纯化的蛋白相比，泳道1中纯化的VP6重组蛋白在约42 ku处条带单一，无其他明显杂带；泳道2中的Ni柱流穿液在约42 ku处有少量条带，蛋白纯化效果较好(见图4)。

图4 S9基因编码重组蛋白经Ni柱纯化后 SDS-PAGE分析结果Fig.4 SDS-PAGE analysis results for the purified protein products of S9 gene coding recombinant protein1.纯化的VP6重组蛋白；2.Ni柱流穿液； 3.未纯化的菌体总蛋白；M.低相对分子质量蛋白质marker

2.5 血清抗体效价的检测

使用间接ELISA方法测定血清效价，结果显示该VP6重组蛋白多克隆抗体效价约为1∶105。

2.6 Western blot分析

Western blot结果(见图5)显示，加入纯化的VP6蛋白的泳道中，约42 ku处出现一条特异性条带；加入纯化的HZ08株的泳道中，约48 ku处出现一条特异性条带；而加入GZ1208、HGDRV、ISKNV、LBMV、SCRV、KHV病毒的孔道中未出现条带。重组蛋白和GCRV Ⅱ型毒株能与制备的多抗血清特异结合，其他病毒与该多抗血清无特异性反应，表明该多克隆抗体特异性高。

图5 Western blot分析VP6蛋白抗血清特性Fig.5 Western blot appraise the peculiarity of serum antibody against VP6 protein1.KHV病毒；2.ISKNV病毒；3.LBMV病毒； 4.SCRV病毒；5.HGDRV病毒；6.GCRV-GZ1208 病毒；7.VP6重组蛋白；8.纯化的HZ08毒株； M.低分子质量蛋白质marker

2.7 间接免疫荧光分析

间接免疫荧光实验结果(见图6)显示，感染GCRV-HuNan1307株和HZ08株的GSB细胞产生特异性的绿色荧光信号，而感染GZ1208、HGDRV毒株的GSB细胞以及未感染病毒的正常GSB细胞中观察不到荧光信号；感染ISKNV、LBMV、SCRV毒株的EPC细胞和感染KHV毒株的KF细胞中均未见到荧光信号。表明制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV Ⅱ型毒株，而不能识别GCRV Ⅰ型和Ⅲ型以及其它病毒。

图6 间接免疫荧光分析VP6蛋白抗血清特性Fig.6 IFA identification of the polyclonal antibody1.感染HuNan1307株的GSB细胞；2.感染 HZ08株的GSB细胞；3.未感染病毒的正常GSB 细胞对照；4.感染GZ1208的GSB细胞；5.感染 HGDRV的GSB细胞；6.感染ISKNV的EPC细胞； 7.感染LBMV的EPC细胞；8.感染SCRV的EPC 细胞；9.感染KHV的KF细胞

3 讨论

VP6蛋白参与GCRV病毒粒子内衣壳蛋白的构成，能连接内衣壳和外衣壳，与哺乳动物呼肠孤病毒的δ2蛋白功能相似[5]。呼肠病毒科包括轮状病毒属和水生动物呼肠孤病毒属，研究人员在对轮状病毒VP6蛋白的研究中发现，VP6蛋白具有高度的免疫原性，但不诱导中和抗体，针对VP6蛋白的抗体在感染轮状病毒的实验组中具有高度的交叉反应性，推测VP6抗体可提供潜在的特异性免疫保护[12]。此外，在一些针对草鱼出血病疫苗研发的研究中，以VP6蛋白作为免疫原可以提供高水平的免疫保护[13-15]，因此，VP6蛋白可以认为是一种用于免疫测定的良好靶蛋白[16]，可以作为制备草鱼出血病基因工程疫苗的候选蛋白。Fang等[17]成功在昆虫细胞(sf9)中融合表达了GCRV VP6蛋白与荧光增强蛋白(EGFP)；周勇等[18]构建了GCRV VP6蛋白与绿色荧光蛋白、大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体，这些研究结果为研发草鱼出血病可饲性转基因动、植物疫苗提供了新思路。Zhou等[19,20]使用GCRV Ⅲ型(HGDRV株)VP6蛋白制备的小鼠多克隆抗体具有高特异性；制备的GCRV Ⅲ型(HGDRV株)VP6蛋白DNA疫苗，在免疫应答早期的效果评价中，该DNA疫苗能够在一定程度上抑制GCRV的增殖以及该病毒诱导的细胞病变效应，显示了良好的免疫效果。

本实验以GCRV Ⅱ型代表毒株GCRV-HZ08的S9基因为研究对象，扩增S9基因，并成功构建pET-32a-S9原核表达载体，蛋白表达形式分析显示该VP6蛋白主要存在于沉淀中，为包涵体蛋白。测定使用该VP6蛋白制备的多克隆抗体效价，结果显示制得的多克隆抗体效价约为1∶105，远高于GCRV Ⅱ型(GCRV-HZ08株)S6片段表达的VP4蛋白制备的多克隆抗体效价(约1∶8 000)[21]，但比HZ08株S10基因片段表达的蛋白制备的多克隆抗体效价(约1∶106)略低[22]。S9片段编码的蛋白诱导制备的抗体效价较高，说明该VP6蛋白免疫原性较好，可以作为研制草鱼出血病基因工程疫苗的候选蛋白。经Western blot和IFA分析可知，制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV Ⅱ型毒株，而不能识别GCRV Ⅰ型和Ⅲ型以及其它病毒，表明该多克隆抗体具有较高的特异性。本实验结果为S9基因片段编码蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、基因工程疫苗的研制以及草鱼出血病的防治奠定了基础；同时，结合Fang、周勇等[17,18]的研究也为我们开发草鱼出血病可饲性转基因动、植物疫苗的研究提供了新思路。

[1]Xu B H,Zhong L,Liu Q L,et al.Characterization of grass carp spleen transcriptome during GCRV infection [J].Genet Mol Res,2016,15(2)：1-16.

[2]Wang Q,Zeng W,Liu C,et al.Complete genome sequence of a reovirus isolated from grass carp,Indicating different genotypes of GCRV in China [J].J Virol,2012,86(22)：12466[z1].

[3]王方华,李安兴.草鱼病毒性出血病研究进展[J].南方水产科学,2006,2(3)：66-71.

[4]Rao Y,Su J.Insights into the antiviral immunity against grass carp (Ctenopharyngodonidella)reovirus (GCRV)in grass carp [J].J Immunol Res,2015,2015(2)：1-18.

[5]Fang Q,Shan S,Liang Y,et al.3D reconstruction and capsid protein characterization of grass carp reovirus [J].Sci China C Life Sci,2005,48(6)：593-600.

[6]Lu J.TNF-α is involved in apoptosis triggered by grass carp reovirus infection in vitro [J].Fish Shellfish Immunol,2016,55：559-567.

[7]李 贤,曾伟伟,王 庆,等.草鱼呼肠病毒研究进展[J].动物医学进展,2016,37(7):94-101.

[8]曾伟伟,王 庆,王英英,等.草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用[J].中国水产科学,2013,39(2)：419-426.

[9]Yan X Y,Wang Y,Xiong L F,et al.Phylogenetic analysis of newly isolated grass carp reovirus [J].Springer Plus,2014,3(1)：1-10.

[10]Pei C,Ke F,Chen Z Y,et al.Complete genome sequence and comparative analysis of grass carp reovirus strain 109 (GCReV-109)with other grass carp reovirus strains reveals no significant correlation with regional distribution [J].Arch Virol,2014,159(9)：2435-2440.

[11]张 超.草鱼呼肠孤病毒HZ08株的分离鉴定与全基因组分子特征分析[D].上海：上海海洋大学,2010.

[12]Tang B,Gilbert J M,Matsui S M,et al.Comparison of the rotavirus gene 6 from different species by sequence analysis and localization of subgroup-specific epitopes using site-directed mutagenesis [J].Virology,1997,237(1)：89-96.

[13]Choi A H,Mcneal M M,Basu M,et al.Intranasal or oral immunization of inbred and outbred mice with murine or human rotavirus VP6 proteins protects against viral shedding after challenge with murine rotaviruses [J].Vaccine,2002,20(27)：3310-3321.

[14]Dong J L,Liang B G,Jin Y S,et al.Oral immunization with pBsVP6-transgenic alfalfa protects mice against rotavirus infection [J].Virology,2005,339(2)：153-163.

[15]Yu J,Langridge W.Expression of rotavirus capsid protein VP6 in transgenic potato and its oral immunogenicity in mice [J].Transg Res,2003,12(2)：163-169.

[16]王 炜,赵桃英,方 勤,等.草鱼出血病病毒多肽的免疫原性[J].中国病毒学,1995,10(2)：166-168.

[17]Fang Q,Seng E K,Dai W,et al.Construction and co-expression of grass carp reovirus VP6 protein and enhanced green fluorescence protein in the insect cells [J].Virol Sin,2007,22(5)：397-404.

[18]周 勇,曾令兵,范玉顶,等.草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建[J].中国水产科学,2011,18(1)：1-7.

[19]Zhou Y,Fan Y D,Zeng L B,et al.Prokaryotic expression and immunoassay of grass carp reovirus capsid VP6 protein [J].Acta Virol,2013,57(4)：456-461.

[20]Zhou Y,Fan Y D,Zeng L B.Construction of a recombinant eukaryotic vector for a grass carp reovirus VP6 gene and its expression in vitro and in vivo[J].Virus Dis,2014,25(1)：69-77.

[21]曾伟伟,王 庆,张乐生,等.草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[J].中国生物制品学杂志,2011,24(12)：1482-1485.

[22]李永刚,曾伟伟,王 庆,等.草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析[J].水产学报,2014,38(3)：449-456.