李氏杆菌感染雌性小鼠生殖器官的病理学观察

彭侃霖，郑文亚，李春林，童静娴，刘 犇

(宜春学院生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000)

李氏杆菌病属于一种人兽共患病，易感动物为羊、猪、牛和兔子等，发病率低但死亡率高[1]，引起发病的主要是单核细胞增多性李氏杆菌，可引起组织中单核细胞浸润，以败血症、脑膜炎、孕畜流产或死胎为主要症状[2]。在以往的病理学试验中，对李氏杆菌致动物病理损伤也有较深入的研究，单核细胞增多性李氏杆菌在动物肝、脾、肾和脑的研究较多[3]，但其对子宫、卵巢和输卵管造成的组织病理损伤的研究报道非常少，因此本试验旨在研究单核细胞增多性李氏杆菌对小鼠生殖器官造成的病理损伤。李氏杆菌可以引起母畜的死胎、流产现象，大大降低了出生率，给畜牧业造成巨大的经济损失[2]，因此，研究李氏杆菌对生殖器官的病理损伤有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与菌种 购买健康、无特定病原菌的雌性昆明系小鼠共12只(湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体重20.5 g±2.1 g)，25 ℃恒温饲养2周。山羊源单核细胞增多性李氏杆菌由宜春学院肉牛(羊)疾病控制实验室提供。

1.2 试验设备与试剂 烘箱、切片机、摊片机、烘片机、显微镜、生物安全柜、计时器、染色架、不同浓度的酒精、二甲苯、苏木精染液、分化液、伊红染液等。

1.3 动物处理与样品采集 将小鼠随机分成两组，每组8只，对小鼠进行称重编号，试验组按0.2 mL/10 g(3×108CFU/mL的细菌生理盐水悬液)的标准腹腔注射李氏杆菌，对照组腹腔注射相同剂量的灭菌生理盐水。观察并记录接种之后小鼠的异常变化，对死亡的小鼠及时进行剖检，观察生殖系统的病理变化并拍照。剖检小鼠后即刻取出卵巢和子宫，用生理盐水冲洗后浸入4%多聚甲醛中固定48 h以上。

1.4 组织切片制备与病理学观察 取出样品流水冲洗24 h，依次放入梯度酒精进行脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。制作4 μm连续切片，经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、苏木精-伊红染色，二甲苯透明后用中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 李氏杆菌感染小鼠临床症状与病理变化 接种后观察发现，试实验组的小鼠被毛杂乱、无光泽，精神亢奋，小鼠出现共济失调，行走不稳，或无目的的转圈，或躲在暗处，或不断后退，直至抵住障碍物，严重时侧卧、抽搐，对外界的刺激反应迟钝，3 d内试验组小鼠全部死亡。病理剖检发现，试验组小鼠皮肤苍白，腹下、股内等部位出现淤血点，肠系膜淋巴结肿大，胃肠黏膜充血，观察生殖器官发现卵巢和子宫充血水肿，呈现淡粉红色或暗红色，部分区域有出血点或出血斑，子宫内可见淡灰红色渗出液，子宫壁明显增厚(见封三彩版图1)。

2.2 李氏杆菌感染小鼠生殖器官的病理组织学观察 病理组织学观察发现与对照组相比，试验组小鼠的子宫角横切面疏松，组织间隙较大，肌层增厚，纵行肌层异常增生(封三彩版图2-1A)；血管层血管内皮细胞发生透明，变性(封三彩版图2-2A)；导致内皮破损，血管充血，部分红细胞渗出进入组织间隙，少量淋巴细胞聚集在血管周围(封三彩版图2-2A)；子宫角黏膜固有层淋巴细胞浸润，并可见腺体萎缩，管腔狭小甚至消失(封三彩版图2-1B)；腺上皮细胞胞核肿大、淡染(封三彩版图2-2B)；细胞破裂，胞浆渗出，间质淡红色物质增多，少量细胞胞浆固缩深染伊红，形成均质的红色嗜酸性小体(封三彩版图2-1B)。子宫内膜单层柱状上皮细胞核染色质固缩并崩解成若干碎片，细胞坏死，上皮脱落(封三彩版图2-1C、2-2C)；固有层淋巴细胞浸润，大量炎性细胞胞浆内出现鲜红色均质半透明物质或出现卵圆形细小空泡(封三彩版图2-1C)；组织细胞部分核几乎透明，仅见细胞核轮廓(封三彩版图2-2C)。卵巢髓质处血管充血，部分血管内膜破损，少量红细胞逸出至组织间隙，并可见大量炎性细胞(封三彩版图2-3A)；卵泡内颗粒细胞异常增多、肿大，颗粒细胞核可见若干高度浓缩的染色质碎片，卵泡腔狭窄，炎性细胞围绕卵泡腔内侧形成新的空腔(封三彩版图2-3B)；部分黄体可见中央区域、甚至全层不同数量的细胞出现空泡化、坏死，表现完全空泡化、空泡中可见部分浓缩的胞质和细胞核或仅见染色质边缘化的细胞核，空泡化细胞旁可见数量不等的胞质深染的细胞(封三彩版图2-3C)。

3 讨论

本试验所用菌种李氏杆菌自江西某羊场发病山羊分离得到，通过细菌分离培养、生化鉴定和分子生物学鉴定，确诊为单核细胞增多性李氏杆菌病，山羊表现严重的神经症状，表现朝向一侧转圈运动、盲目运动或遇障碍物抵住不动，此外，可见单侧眼有脓性分泌物、失明、呼吸困难和母羊流产等症状。李氏杆菌通过饮食进入消化道，免疫力降低时该菌就会进入肝脏繁殖，最后进入血液与淋巴循环系统，到达生殖系统后对生殖器官造成一定程度的影响[4]。本试验中，病理剖检发现，雌鼠子宫肿大充血，病理组织学观察发现子宫内膜上皮脱落、腺上皮不完整、肌纤维变形肿胀、充血出血和部分细胞坏死，这些病理损伤可能干扰早期胚胎发育、妊娠识别和胚胎着床等生殖活动，造成雌鼠不易受孕，妊娠率降低。此外，可见卵巢卵泡颗粒细胞出现凋亡、黄体细胞发生空泡化、坏死或凋亡以及卵巢中炎性细胞浸润等病理损伤，这些现象与受孕率降低相关，黄体病变表明李氏杆菌对黄体细胞也造成损伤，黄体内炎性细胞分泌一些活性物质，炎灶内物质分解代谢加强，酸性代谢物质增多，渗透压增高，正常细胞受到致炎因素干扰，细胞代谢和信号转导遭到破坏，部分细胞崩解破坏消亡形成空泡，对于妊娠动物来说，黄体细胞遭到破坏将导致孕酮分泌降低，从而使其不易受孕或易发生流产[5]。李氏杆菌是胞内寄生菌，当它受到免疫细胞的威胁时，会侵入细胞内躲避追捕，并与原细胞争夺营养，一般情况下，细菌被吞噬细胞吞噬后会形成吞噬泡，此时溶酶体会与吞噬泡结合释放酸性物质从而降解菌体，但是李氏杆菌可以分泌溶血素和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，可溶解吞噬体膜使得细菌逃离吞噬体的杀菌物质，增加巨噬细胞细胞膜通透性，诱导细胞凋亡，逃离巨噬细胞，进入宿主细胞胞浆汲取营养并大量增殖，对宿主细胞产生不良影响[6-7]。

李氏杆菌病在羊场或牛场常呈散发性，易造成死亡，并对母畜的生殖器官造成一定的破坏，本试验结果证实了李氏杆菌会对未孕雌鼠的生殖器官造成广泛的损伤，提示李氏杆菌对家畜生殖系统也可能存在较大的病理损伤，可能与养殖场母畜受孕率低、流产和死胎等现象相关。为了减少李氏杆菌病对养殖场造成的重大经济损失，做好预防工作非常重要。李氏杆菌可经口传播，抵抗力降低时易感[1]，因此对饲料有一定的要求，应提高饲料的营养、保证饲料的品质，防止饲料霉变。畜舍要保持干燥通风、及时清理粪便、定期进行消毒，并要消灭蚊虫减少传播途径。发病动物应尽快隔离，并对栏舍及所有用具进行消毒，对已死亡的动物要及时无害化处理，减少细菌的传播。

本试验通过对感染李氏杆菌小鼠进行病理学观察，证实了李氏杆菌能够严重损伤卵巢和子宫等雌性生殖器官，与李氏杆菌感染动物受孕率低下、流产和死胎等相关，为李氏杆菌病的防治提供参考资料。