热应激模型评价及其降低猪采食的机制研究进展

熊云霞，王 丽，易宏波，温晓鹿，邱月琴，田志梅，蒋宗勇

（广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州 510640）

由于猪存在大量皮下脂肪堆积、代谢产热高且缺乏汗腺，当环境温度超过热中性区时，猪的热载荷超过散热，会产生热应激，出现咬尾、呼吸急促、不喜采食、饮水增多等行为[1]。热应激严重影响机体的能量代谢平衡，使猪生产性能降低，平均日采食量（ADFI）和平均日增重（ADG）降低、耗料增重比（F/G）增加，当环境温度为20～30 时，温度每升高1 ，猪的平均日采食量降低40～80 g[2]。为了增加散热，猪血液更多地流向外周皮肤组织，导致肠道组织缺血缺氧，引起肠道绒毛脱落，肠道形态改变，屏障功能和吸收功能损伤[3-5]。热应激降低消化酶活性，破坏消化道的菌群平衡[6]，使猪的消化吸收功能严重受阻，进一步影响猪的生长。热应激还会导致猪的免疫力减弱，血清中炎症因子含量升高[7]，抗病能力降低，致病致死率升高。高温环境影响猪的肌肉pH[8]，提高脂肪组织中脂肪的存储进而影响肌肉品质[9]。热应激导致母猪受胎率、平均窝产仔数、产活仔数、初生窝重均降低，对猪的繁殖效率影响严重[10]。中国广东省处于亚热带地区，夏季潮湿炎热，且持续时间较长，生产实践中的营养调控措施尚不能有效缓解热应激效应，给养猪产业带来了巨大的经济损失。猪热应激的相关研究已经从动物试验水平深入到分子水平[11]，相关的组学研究也已取得进展[12]，但是现有研究中热应激模型条件缺乏统一标准，且多局限在生理生化指标变化的检测与分析。热应激导致猪采食量降低，热应激对采食相关信号及通路的影响已有不少文献探索，但是由于动物的采食调控机制复杂，热应激影响采食的分子机制还需要更深入的研究。本文主要综述了猪的热应激模型、热应激影响猪采食调控的分子机制，为猪生产实践中探索有效的缓解热应激措施提供理论参考。

1 热应激模型

1.1 热应激模型评价 猪正常体温为38～39.5 ，其需要的环境适宜温度随体重、日龄、所处阶段不同而不同，初生仔猪的适宜温度为27～29 ，断奶仔猪为21～24 ，生长育肥猪为20～23 ，妊娠和哺乳母猪为16～18 。猪对温热环境敏感，敏感程度与品种、日龄、性别、所处阶段、营养状况、饲养管理、应激强度、持续时间等有关。温热环境包括温度、相对湿度、风速、热辐射及热传递等因素，它们共同作用使动物产生冷或热、舒适与否的感觉。热应激程度一般随温度的升高而加剧，但是不同的气温、风速和热辐射在一定条件下也可以对动物体温调节产生相同的影响；相同温度不同湿度的情况下，动物感受也不同，高温高湿环境下由于蒸发散热减少会导致热应激效应更明显[13]；因此仅仅参考体温和舍温难以全面反映热应激程度。用有效环境温度评定温热环境因素，即动物在环境中的实际感受温度，非常贴合实际，但是在生产应用中定量困难。现有研究通常用温度结合相对湿度来评价外界环境，即温湿度指数（Temperature Humidity Index，THI），THI=0.72（Td+Tw）+40.6，其中Td是干球温度（ ），Tw是湿球温度（ )[14]。Shoshani等[15]又在温度和相对湿度的基础上加上了风速。由于国内外热应激模型条件暂时没有统一标准，导致很多实验室的研究结果不完全一致，甚至有时会出现自相矛盾的结果，因此能够定性和定量的热应激模型和评价机制对于深入研究热应激机制显得尤为重要。

热应激致使猪行为学和生理学发生改变，如体温、心率、饮水量升高，呼吸急促，采食量降低，血液生化指标也发生变化。张根军[16]研究发现，生长猪血液中无机离子K+，谷草转氨酶（Glutamic Oxaloacetic Transaminas，GOT）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、 磷 酸 肌 酸 激 酶（Creatine Phosphokinase，CPK）等酶，皮质醇激素 (Cortisol，COR)、热应激蛋白（Heat Shock Proteins，HSP）对短期急性热应激（0.5 h内温度从19 升至40 并保持3 h后迅速降至19 ，相对湿度保持在50%～60%）比较敏感。而长期持续慢性热应激（对照组温度18～26日变，试验组25～37 日变，2周相对湿度都保持在50%）不同于短期急性热应激，除血液中谷丙转氨酶（Glutamic Pyruric Transaminase，GPT）、GOT、LDH、CPK等酶的活性明显升高，且均随热应激时间延长而升高外，血液中K+浓度无明显差异，且COR呈先升高后降低的趋势，HSP明显升高后，在后续维持的高温期内比较恒定。猪对急性和慢性应激反应的血液生化指标变化不完全一样，可能是由于血液生化指标在不同生长阶段对外界应激的敏感度不同且某些生化指标本身也不稳定。另外，短期热应激和长期热应激的反应不同不止表现在生化指标上，也表现在基因水平上。Schwimmer等[17]研究表明，在小鼠短期应激模型（2 d，34 )中，离子通道、转运载体、介导信号基因瞬时上调，而这些基因在经历长期热应激（30 d，34 ）后会回到应激前水平，可能是长时间的应激刺激使动物对温热环境产生耐受，但是编码代谢率和采食相关的激素和神经肽的基因在短期和长期应激中均下调。热应激还会引起机体氧化-抗氧化系统变化，导致血液或者组织中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）升高，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）等抗氧化酶的活性降低，这些指标也可以用于评价热应激模型[18]。

1.2 建立热应激模型的建议 影响温热环境的因素复杂，不稳定不可控因素众多，定性和定量困难，难以建立统一的热应激模式。目前，对猪热应激影响规律的研究一般是通过人工气候舱模拟温热环境条件，模型中的高温控制一般是通过短时间急骤升高后维持或者是模拟日变高温气候的升温曲线模式来实现，但是用在严格控制的温度环境下获得的数据来预测实际生产中连续变化温度下的指标并不准确，因此目前的热应激研究模型仅为实际生产提供参考。在做热应激机制的研究中很有必要加入采食配对组，即适宜温度条件下，采食量和高温组等量的试验组，研究是否由于采食量变化导致热应激效应的发生。在建立猪的热应激模型时，建议试验设置的条件尽量贴合生产实际情况，如短时间急性热应激条件用于研究模拟短途或者长途运输条件中热应激效应，而长时间持续热应激条件尽量模拟饲养地区的自然气候变化，以便更好地研究热应激对猪生产造成影响的规律[19]。建立精确的环境参数数据库，以行为和生理变化（体温、呼吸频率、心率、饮水量、采食量等）作为辅助监测手段，筛选敏感的内分泌和血液生理生化指标，结合相关的基因检测，可作为建立热应激模型的研究方向。

2 热应激影响采食的分子机制

2.1 采食调控机制 动物的食欲和采食行为主要受饲料（成分、营养水平、原料的新鲜度、料型、颗粒硬度）、环境（温度、相对湿度、光照、风速、热辐射、热传递等）、饲养管理（自由采食或限饲、断奶、换料、饲养密度等）、动物生理状况（饥饱、健康状况等）等影响[20]。采食调控机制极其复杂，且调节机制目前仍不十分清楚，本文主要简述外周和中枢采食因子、大脑采食奖赏系统的调控机制。

外周采食调节系统主要包括视觉系统、嗅觉系统、触觉系统、味觉系统、胃肠道、肝脏、脂肪组织、胰脏及肌肉等，通过自主神经系统，或采食调节因子，与大脑进行密切的双向反馈沟通，大脑发挥主要作用的是尾部脑干、下丘脑、大脑皮质及边缘系统3个部位。尾部脑干包含指导采食动作及从消化道摄取营养的关键自主神经元，可接受来自味蕾的味觉信息及胃肠道的迷走神经介导的营养物质信息[21]。采食调节因子按效应时间长短可分为短期和长期调节因子。短期调节因子包括胃肠道系统分泌的胃肠调节肽（Gastrointestinal Peptides）如促采食因子饥饿素（Ghrelin），厌食因子胃泌酸调节素、胆囊收缩素（Cholecystokinin，CCK）、酪酪肽（Peptide YY，PYY）、肥胖抑制素（Obestatin）、胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like Peptide-1，GLP-1）等，以及营养物质如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸。动物采食后，营养物质进入胃肠道，与胃肠道内存在的相应化学受体结合，刺激胃肠道内分泌细胞合成分泌胃肠调节肽参与食欲调节。胃肠调节肽穿过血脑屏障与中枢调节系统相应受体结合，或者直接刺激内分泌细胞附近的传入神经末端上的迷走、脊柱及肠肌间神经元，引起传入神经纤维兴奋，将信号传至中枢神经系统，进而影响采食。短期调节由味觉系统、胃肠系统及中枢神经系统协同参与完成。长期调节因子，包括肥胖信号分子如来自胰腺的胰岛素（Insulin）和胰多肽、来自脂肪细胞的瘦素（Leptin）和脂联素（Adiponectin，ADPN）、白细胞介素等，长期调节取决于体内能量储备，动物根据体内的脂肪储备情况，调节采食行为[22]。

中枢神经系统整合、加工传入的复杂外周采食信号，感知机体的营养及能量状态，对采食进行网络调控，是采食调节和能量平衡的关键。采食调控中枢主要位于下丘脑的弓状核（Arcuate，ARC）、腹内侧核（Ventromedial Hypothalamic，VMH）、 背 内 侧 核（Dorsomedial Hypothalamus，DMH）、外侧区（Lateral Hypothalamic Area，LHA）和脑干尾部的孤束核[23]。下丘脑是中枢采食调控的关键，其含有大量的食欲调节神经元，可以整合来自外周的采食信号，调控采食行为。下丘脑中最主要的食欲调控位点是ARC，其中包含了2类一级食欲调控神经元：促食的神经肽刺鼠蛋白相关蛋白（Neuropeptide Y/agouti-related Neuropeptide，NPY/AgRP）和厌食的前黑素细胞皮质素原可卡因苯丙胺调节转录肽（Proopiomelanocortin/Cocaineand Amphetamine-regulated Transcript，POMC/CART）。NPY通过G蛋白耦联受体发挥作用，NPY受体包括Y1、Y2、Y4、Y5、y6。NPY 神经元可以通过NPY1受体，或者轴突侧枝分泌的神经递质γ-氨基丁酸直接抑制相邻POMC神经元。POMC裂解产生多种肽类激素，其中之一是厌食因子α-促黑激素（α-melanocyte-Stimulating Hormone，α-MSH），可以结合并激活黑素皮质素3/4（Melanocortin 3/4，MC3/4）受体从而抑制采食[24]。Leptin、insulin和来自葡萄糖代谢的ATP可通过介导ATP依赖钾通道（ATP-dependent Potassium Channels，KATP）直接控制POMC和AgRP神经元的电兴奋性。一级神经元的轴突投射到二级神经元，它们一部分分布于下丘脑室旁核（Paraventricular，PVN），另一部分分布于下丘脑LHA和穹隆周区（Perifornical Area，PFA）。PVN含有大量的抑食神经元，分泌促甲状腺激素释放激素（Thyrotropin-releasing Hormone，TRH）、促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH）和垂体后叶催产素（Oxytocin，OXY），LHA及PFA则含有促食神经元，分泌黑色素浓集激素（Melanin-concentrating Hormone，MCH）和食欲素（Orexin）。下丘脑对采食行为的调节包括采食量和采食节律，下丘脑除了是采食中枢还是昼夜节律中枢，采食行为会受到昼夜节律的影响，反过来采食行为又可以产生一定的昼夜节律，破坏小鼠的clock基因会使小鼠产生肥胖、食欲过剩和葡萄糖代谢异常[25]。

采食奖赏由复杂的神经系统处理，包括腹侧纹状体内的伏隔核和腹侧苍白球、中脑腹侧被盖区、前额叶皮层、海马体和杏仁核。μ-阿片受体和多巴胺系统在采食奖赏系统中起关键作用。注射μ-阿片受体激动剂可导致采食增加。采食奖赏与动物学习和记忆系统有关[26]。

2.2 热应激对采食信号的影响 热应激条件下，下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-Pituitary-Drenal，HPA）反应轴激活，下丘脑通过释放CRH控制垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH），ACTH的释放促进了肾上腺皮质分泌糖皮质激素。在下丘脑，糖皮质激素受体影响促食欲神经肽NPY的表达[26]。热应激上调leptin和ADPN及其受体的表达[27]，leptin可直接作用下丘脑导致采食减少，ADPN作为饱食信号，可通过外周和中枢信号机制调节采食行为。急性热应激导致胃肠道ghrelin和CCK表达改变从而影响采食[28]。热应激引起机体内能量平衡变化，导致肠道营养素受体改变如碱性氨基酸转运载体1（Cationic Amino Acid Transporter-1，CAT1）、 钠 -葡萄糖共转运载体1（Sodium-glucose Cotransporter1，SGLT1）、葡萄糖转运载体4（Glucose Transporters 4，GLUT4）表达升高[29]，导致机体营养素感受水平变化进而影响采食。

2.3 热应激对采食信号通路的影响 热应激导致猪采食量降低，机体出现能量代谢支出和摄入不平衡，因此研究热应激对采食信号通路的影响，细胞能量感受通路雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic Target of Rapamycin，mTOR）通路和5'-磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5'-AMP-activated Protein Kinase，AMPK）通路受到广泛关注。

mTOR是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，可以促进蛋白合成，抑制细胞自噬，调控细胞周期和增殖，能够感受细胞能量状态的变化，细胞内ATP可以激活mTOR通路。mTOR在营养感受和能量平衡调控的脑机制中发挥重要作用，下丘脑mTOR信号通路在中枢神经系统采食量调节中起着重要的作用[30]。氨基酸混合物、L-亮氨酸、leptin可激活下丘脑的mTOR信号通路引起动物采食量降低，体重减轻，且抑制mTOR信号通路可以减弱leptin的厌食作用，mTOR主要通过调控磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-mTOR（Phosphatidylinositol 3 kinase- protein Kinase B-mTOR，PI3K-Akt-mTOR）通路和mTOR-真核起始因子4E结合蛋白1/核糖体p70S6激酶-NPY/AgRP（mTOR-eIF4 E-binding protein 1/p70 ribosomal protein S6 kinase-NPY/AgRP，mTOR-4EBP1/p70S6K-NPY/AgRP）通路调控采食[31]，热应激导致采食量降低可能是热应激激活了猪下丘脑mTOR信号通路。

AMPK即丝/苏氨酸蛋白激酶，是由催化亚基α、调控亚基β和γ组成的异源三聚体，是细胞重要的能量感受器，能通过增强分解代谢通路，抑制合成代谢通路，调节代谢和能量平衡。AMPK活性受AMP/ATP和上游激酶调控。下丘脑AMPK在抑制食欲的激素调节、采食信号通路和能量平衡过程中起着至关重要的作用，下丘脑中负调控AMPK的表达可以有效降低食欲和体重，反之可以提高采食量和体重，且主要是α2AMPK在采食调控中起作用[32]。AMPK主要通过AMPK-乙酰辅酶A羧化酶-肉碱棕榈酰转移酶1（AMPK-acetyl CoA Carboxylase-carnitine Palmitoyltransferase 1，AMPK-ACC-CPT1）和解偶联蛋白2-叉头框O1-磷酸化cAMP相应元件绑定蛋白（Uncoupling Protein2-fork Head Box Protein O1-phosphorylated Camp Response Element Binding Protein，UCP2-FOXO1-pCREB）2条信号通路对采食进行调控[33]。Leptin、insulin可通过抑制下丘脑中的AMPK活性达到抑制采食作用，leptin通过p70S6激酶磷酸化AMPK 491位丝氨酸导致AMPK活性下降，而持续激活AMPK可使leptin的作用失活[34]。通过禁食和喂食改变下丘脑中AMPK活性，可以大幅度改变下丘脑弓状核神经肽的表达，低能量状态会激活AMPK活性从而上调NPY下调POMC，使动物采食增加。AMPK和mTOR在AMPK-肿瘤抑制基因-mTOR（AMPK-tuberous Sclerosis Complex mTOR，AMPKTSC-mTOR）通路、固醇类调节因子绑定蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Protein，SREBP）基因表达和吞噬启动激酶1（Unc-51-like kinase 1，Ulk1）活性通路上存在互作[35]。AMPK被激活后可直接磷酸化mTOR的第2446位上的苏氨酸而抑制其活性。热应激抑制AMPK活性。热应激条件下，磷酸酯酶2A（Phosphatase 2A，PP2A）介导AMPKα去磷酸化，可导致AMPK下游目标基因乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，Acetyl-CoA）去磷酸化和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEP）上调[36]。

FoxO1和信号传导与转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）是近些年鉴定的参与采食量调节的关键转录因子，它们的结合位点都在下丘脑内NPY/AgRP和POMC基因的启动子附近，但2个转录因子对采食调节的效应相反，FoxO1转录激活NPY/AgRP基因的表达，抑制POMC基因的表达，进而促进摄食；而STAT3的激活则下调NPY/AgRP基因的表达，上调POMC基因的表达，进而抑制摄食，insulin、leptin对采食调控的多条通路就涉及了这类转录因子[37]。

热应激可影响外周食欲信号的表达，经AMPK信号通路、mTOR信号通路或FoxO1/STAT3通路影响采食中枢从而调控采食。

2.4 热信号因子 猪是恒温动物，下丘脑的视前区（Preoptic Anterior Hypothalamus，POAH）是体温调节中枢，环境温度变化时，存在皮肤、内脏、黏膜等组织的温度感受器通过神经系统将信号传递给体温调节中枢，整合来自不同温度感受器的信息做出反馈和调节。

机体热信号的传入主要是通过瞬时受体电位离子通道（Transient Receptor Potential ion Channels，TRPs）来完成，传出途径则主要依靠植物性神经系统和内分泌系统。TRP蛋白为非选择性阳离子通道，激活时引起Ca2+内流，为受体活化钙通道。哺乳动物中所有的TRP通道都是6次跨膜多肽亚基组装成的四聚体形成的阳离子渗透孔，按功能分有味觉感受TRP、温度感受TRP、感光TRP、触觉感受TRP。现已发现6个TRP家族成员与温度感受相关，即TRPVl、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8、ANKTM1，其中 TRPVl、TRPV2、TRPV3、TRPV4能感受温热刺激，TRPM8（＜25 ）、ANKTM1（＜18 ）可感受冷刺激。当温度高于42 会增强TRPVl的Ca2+通透，TRPV2结构与TRPVl有50%结构同源，TRPV2介导温度高于52 的高阈值有害高温热感，温度高于31 和25会分别激活TRPV3和TRPV4，TRPs被阻断或者缺失时会造成动物对环境温度敏感性的变化[38]。环境温度升高时，TRPs如何变化以及这种变化如何传递进而影响到动物采食还不清楚。

比较受瞩目的热应激诱导基因有HSP和热休克因子（Heat Shock Factor，HSF），参与许多信号调节通路，对细胞起保护作用。HSP是一类分子伴侣蛋白，在应激状态下，参与细胞防御和修复，保证蛋白的正确折叠，维持细胞稳态。环境温度升高，生物体通过关闭大部分蛋白的合成并开始合成HSP来应对可能的机体损伤。体温升高后，在大脑内表达量升高的HSP主要有HSP70、HSP90等。HSF是热休克基因转录所必需的一个转录因子，它对提高细胞在应激状态下的生存力、正常发育、延长寿命和癌症的调节有重要作用。在正常情况下，HSF通过与HSP结合而受到抑制，没有活性。当细胞受到应激时，HSF1从HSP-HSF1复合体上释放下来，在胞质中组成三聚体，磷酸化后进入细胞核，与热休克基因启动子区域上的热休克反应原件（Heat Shock Response Element，HSE）结合，进而启动热休克基因转录，提高HSP的合成。HSP常常是一项定性监测动物受应激与否的指标，但HSP不能敏感地反映热应激程度，可能是由于长时间处于温热环境使机体产生了一定的耐受。对热信号分子间的互作研究发现，TRPV1的翻译开始区上游-919到-910位置存在HSE，可以与HSF1结合从而增强TRPV1的表达[39]。对热信号和采食信号关系的研究显示，注射leptin可导致鸡下丘脑和肝脏中HSP70表达下降[40]；而3T3-L1脂肪细胞在热应激状态下，leptin和Hspa2mRNA表达同时升高[41]。造成结果不同的原因可能是前者是体内研究，可通过中枢神经调控，而后者只是体外细胞实验条件。AMPK激活可以显著降低HSP70mRNA的稳定性，热应激条件下，PP2A介导AMPK抑制导致HSP70蛋白表达上调，使细胞更能适应热环境[36]。

热应激导致机体热传入信号和热诱导信号改变，热信号和采食信号存在互作，但是下丘脑体温调节中枢与采食中枢如何进行信号传递还缺乏足够认识。

3 小结及展望

热应激严重影响猪的生产性能，降低采食量。国内外有关猪的热应激模型的评价条件还缺乏一致标准，猪热应激模型的建立有待进一步研究。热应激影响外周采食信号，并通过AMPK信号通路、mTOR信号通路或FoxO1/STAT3通路影响采食中枢从而调控采食；热应激导致机体热传入信号和热诱导信号改变，热信号在传入下丘脑后，可能会以某种方式从体温调节中枢传递到摄食调节中枢，引起采食量改变。动物采食调节是一个极其复杂的过程，其调节机制仍不是十分清楚。下丘脑采食中枢与体温调节中枢的信号传递和互作可作为研究热应激影响采食的新的探索方向。