柔嫩艾美耳球虫重组IL-2-EtMIC-2质粒的免疫效力研究

李蕴玉,张召兴,李佩国,张香斋,贾青辉,闫艳娟,常超越

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北 秦皇岛 066604)

目前,由于抗球虫药物残留和耐药虫株等问题的出现,使得新型疫苗的研发成为预防鸡球虫病的主要发展方向。EtMIC-2是球虫微线上的一类酸性蛋白质,在阻断子孢子侵入宿主细胞时起重要作用[1]。已有研究表明,EtMIC-2基因的表达产物能诱导鸡体对E.tenella产生一定的免疫保护作用[2],并对堆型艾美耳球虫的感染也有交叉保护作用[3],因而EtMIC-2基因是一个良好的疫苗候选基因。

细胞因子作为疫苗高效免疫增强剂的研究已成为免疫佐剂研究的一个新方向。Min等[4]发现,IL-2等细胞因子联合运用可明显增强堆型艾美耳球虫pcDNA3-1E的免疫效果,降低球虫的复制,提高肉鸡增重。侯洪烈等[5]构建的基因重组卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2对E.tenella卵囊的攻击具有一定的保护作用,其ACI分别为176.08和172.89。但鸡IL-2对球虫EtMIC-2质粒的免疫增效作用尚未见报道。为此,本研究将构建的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2 和 pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2质粒分别免疫雏鸡,研究其对E.tenella卵囊攻毒后的免疫保护效果,为新型球虫疫苗的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 球虫卵囊、质粒E.tenella河北株孢子化卵囊、pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2 和pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2质粒均由河北省预防兽医学重点实验室提供;鸡球虫四价活疫苗,购自佛山市正典生物技术有限公司。

1.2 试验动物 1日龄海蓝褐雏鸡,饲喂无抗球虫药的全价饲料。

1.3 试验设计与指标测定 将240只试验用鸡于14日龄早晨逐只空腹称重,根据体重离散度随机分成8组,每组30只,第1、2组分别为阳性对照和阴性对照,在14、21日龄时,第3组每只肌肉注射pcDNA3.0-IL-2 100 μg,第 4 组每只肌肉注射 pcDNA3.0-EtMIC-2 100 μg,第 5、6、7 组每只分别肌肉注射 50 μg、100 μg、150 μg 重组 pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2质粒,第8组在21日龄滴口免疫鸡球虫病四价活疫苗,阳性对照组和阴性对照组用PBS代替。饲养至28日龄时,除第2组(阴性对照组)外,每只鸡经口灌服4×104个E.tenella卵囊,试验期间观察记录各组鸡的精神、食欲及排泄物状况,对死亡鸡剖检并记录死亡原因,试验至35日龄结束。按照美国默克(Merck)公司的计算公式计算ACI,ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)[6]。ACI≤120为无效,ACI=120～160为中等有效,ACI=160～180为良好,ACI>180为优秀。

1.3.1 相对增重率 相对增重率(%)=(阳性对照组以及各免疫组鸡平均增重/阴性对照组鸡平均增重)×100%。

1.3.2 存活率 存活率(%)=(组内鸡存活数/组内鸡总数)×100%。

1.3.3 病变值 于感染球虫后第7天(即35日龄),随机取5只鸡剖杀,按Johnson等[7]的方法做鸡的盲肠病变记分,两侧盲肠病变不一致时以严重一侧为准。病变值=每组平均病变记分×10。

1.3.4 卵囊值 于感染球虫后第7天收集各组鸡的粪便,碾碎并搅匀,然后称取2 g,加入60 mL饱和盐水,经充分搅匀后,用McMaster′s法计数,计算克粪便卵囊数(OPG值)。卵囊比数=(阴性对照组或试验组卵囊数/阳性对照数卵囊数)×100%,卵囊值与卵囊比数关系如下:卵囊比数分别为1%以下,1%～25%,26%～50%,51%～75%和76%～100%时,卵囊值分别为0,5,10,20和40。

2 结果与分析

由表1可知,试验期间,阴性对照组鸡的精神、食欲、粪便均无明显异常,也未出现死亡。而阳性对照组和免疫各组在攻虫后第4天出现不同程度的稀便、血便和死亡,其中6、7、8组存活率和相对增重率最高,存活率均达95%,相对增重率分别为81.3%、81.7%和 82.9%,阳性对照组最低,存活率和相对增重率分别为70%和71.8%,其余各免疫组的存活率和相对增重率介于两者之间。各免疫组的病变值均低于阳性对照组,其中7、8组的病变值最低,均为6.7。各攻虫组在攻虫后均有不同数量的卵囊排出,其中以阳性对照组和3组排出量最多,卵囊值均为40,而6、7、8组的卵囊值最低,均为5,其他免疫组的卵囊值介于二者之间。若以ACI综合评价其抗球虫效果,阳性对照组ACI仅为71.8,提示本次感染的E.tenella卵囊的毒力较强。3～8组的 ACI较阳性对照组分别提高了 18.25%、82.14%、97.63%、127.02%、129.81%和 131.48%,说明各重组质粒对E.tenella卵囊的感染均具有一定的保护作用,且免疫 pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2对E.tenella卵囊感染的免疫保护效果优于单独免疫 pcDNA3.0-IL-2和 pcDNA3.0-Et-MIC-2组,并随免疫剂量的增加,其ACI呈上升趋势,其中6、7组的ACI均达到160以上,呈现抗球虫效果良好水平,并与球虫活疫苗组的ACI相当。

3 讨论

目前,在鸡球虫疫苗研制方面,如何增强基因工程疫苗的免疫效果成为研究的一个热点,选用适当的佐剂如细胞因子来提高鸡球虫基因工程疫苗的免疫效果是目前常采取的策略之一。据报道,鸡IL-2作为新型免疫增强剂可显著增强鸡传染性囊病[8]、鸡新城疫[9]、禽流感[10-12]等疫苗的免疫效力,提高抗体整齐度和延长抗体持续时间。目前,发现鸡IL-2在抗球虫方面也起一定作用。谢昆等[13]研究表明,重组IL-2蛋白能有效减轻攻虫后盲肠病理变化、降低卵囊排出量、增加相对增重。Min等[4]发现,IL-2等细胞因子联合运用可明显增强堆型艾美耳球虫pcDNA3-1E免疫的效果,降低球虫的复制,提高肉鸡的增重。侯洪烈等[5]报道,pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2重组卡介苗对E.tenella卵囊的攻击具有一定的保护作用,其ACI分别为176.08和172.89。 本试验结果表明,将构建的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重组质粒分别以 50、100、150 μg/只的剂量免疫雏鸡,其ACI分别比阳性对照组提高了 97.63%、127.02%、129.81%,与免疫 pcDNA3.0-IL-2 和 pcDNA3.0-EtMIC-2组比较,其 ACI分别提高了 67.14%、91.99%、94.35%和 14.81%、31.88%、33.50%。 由此说明,免疫pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重组质粒对E.tenella感染的免疫保护效果优于单独免疫pcDNA3.0-IL-2 和 pcDNA3.0-EtMIC-2 组,并随免疫剂量的增加,其ACI呈上升趋势,其中当免疫剂量为100、150 μg/只时,抗E.tenella攻击的保护率均高达95%,并能抑制卵囊的繁殖,减轻对肠道的损伤,提高鸡的增重,从而使ACI均高于160,达到抗球虫良好的水平,与球虫疫苗组相当,这表明鸡IL-2能明显增强EtMIC-2质粒的免疫效果,提高其免疫保护作用。

参考文献:

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[3] Takanori Sato,Atsushi Yasuda,Erik P,et al.In ovo vaccination with the Eimeria tenella EtMIC-2 gene induces protective immunity against coccidiosis[J].Vaccine,2005,23(28):3 733-3 740.

[4] Min W,Lillehoj H S,Weining K C,et al.Adjuvant effects of IL-1,IL-2,IL-8,IL-15,INF-alpha,IFN-gamma,TGF-beta and lymphotaction on DNA vaccination against Eimeria acervulina[J].Vaccine,2001,20(2):267-274.

[5] 侯洪烈,张许科,李运娜,等.ADF-IL-2基因重组卡介苗的构建及免疫保护效果[J].中国兽医学报,2013,33(7):1 016-1 020.

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[13] 谢昆,李祥瑞.重组鸡IL-2的抗球虫作用[J].中国兽医杂志,2006,42(8):7-9.