miR-200c对三阴性乳腺癌上皮间质转化的抑制作用及其机制

马啸天,岳小欣,荣守华,张玉超,田 远,石 瑛,李君芳,贾莉婷

(1. 郑州大学第三附属医院检验科，河南 郑州 450052；2.河南省高等医学专科学校药学系，河南 郑州 451191；3.河南省漯河市中心医院，河南 漯河 462000)

基底样乳腺癌因其雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone,receptor,PgR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达阴性而被称为三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌细胞分化程度差，易出现早期复发和转移，并缺乏有效的治疗措施，患者预后较差。上皮间质转化(epithelial-mensenchymal transition,EMT)为其主要的细胞转移形式，主要表现为上皮细胞的极性丢失，细胞间失去黏附能力并获得间充质细胞特性，伴有迁移能力的增强[1-2]。EMT的发生发展来源于多个趋化因子和信号通路的共同作用，其中趋化因子vimentin和Wnt信号通路关键蛋白β-catenin常在三阴性乳腺癌中高表达，其蛋白的表达异常增高常被认为是EMT发生的标志性变化[3-4]。miR-200c为短小核苷酸编码序列，已被证明与肿瘤发生密切相关，主要通过结合相应靶基因3′非编码(3′UTR)区，抑制靶基因转录从而调节肿瘤生长，其在结直肠癌中可以降低vimentin的表达从而抑制EMT[5]，在乳腺癌相关miRNA的基因分析中，miR-200c也常作为β-catenin的目标基因，起到肿瘤抑制的作用[3]。然而，miR-200c在三阴性乳腺癌中是否与vimentin和β-catenin表达有关联，尚未见相关报道。本课题组研究[6]证实：miR-200c能够结合EMT相应转录因子(slug)从而抑制三阴性乳腺癌EMT。本文作者在此基础上，探讨miR-200c是否可以通过调节β-catenin和vimentin表达水平，从而降低细胞的迁移和增殖能力，最终抑制三阴性乳腺癌EMT。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-549均购于上海ATCC细胞库。miR-200c质粒和negative control 由广州锐博生物科技公司合成，转染用试剂Lipo2000购自美国Invitrogen公司，RNA柱式提取试剂盒和荧光定量试剂盒购自上海生工生物工程公司，逆转录试剂盒购自日本东洋纺公司，vimentin和β-catenin单克隆抗体购自美国Cell-Signing-Technology公司，CCK8试剂盒购自日本同仁科技有限公司。

1.2 细胞培养MDA-MB-231和BT-549细胞均采用含有双抗的PRMI 1640完全培养基放置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，取对数生长期的细胞进行消化传代以及后续实验。所有实验均为3复孔，结果取均值，并重复3次。

1.3 实验分组和转染取对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔接种2×105个细胞并进行培养，待细胞生长至孔面积的70%～80%时进行转染操作。根据转染物将其分为空白对照组、阴性对照组组(转染nagtive control/Lipo2000)、试剂对照组(转染Lipo2000)和实验组(转染miR-200c mimic/Lipo2000)。

1.4 RT-PCR法检测细胞中β-catenin和vimentin mRNA表达水平根据生工柱式提取说明书要求，待6孔板中的细胞融合之后，进行总RNA提取，并根据各组RNA的相对浓度和纯度将其逆转录为cDNA，采用RT-PCR法检测相应组别的Ct值。采用2-ΔΔt法计算vimentin和β-catenin mRNA相对表达水平。

1.5 Western blotting法检测细胞中vimentin和β-catenin蛋白表达水平取转染后48 h的各组细胞系，加入120 μL细胞裂解液裂解细胞并收集至EP管中充分震荡30 min，12 000 r·min-1离心6 min得到蛋白提取液，并进行电泳，电泳结束后将胶内蛋白电泳转移至PVDF膜上。用TBS 1∶1 000稀释一抗，室温孵育后4℃过夜。用脱脂奶粉稀释二抗，室温避光2 h，用TBST溶液充分洗涤，放入扫描仪扫描PVDF膜并拍照，计算相应条带的灰度值，以GAPDH为内参，用vimentin/GAPDH和β-catenin/GAPDH比值表示各组细胞中vimentin和β-catenin蛋白相对表达水平。

1.6 CCK8法检测细胞增殖率将对数生长期的细胞按5 000个/孔均匀接种至96孔板中，待细胞覆盖孔底面积70%时进行转染，终浓度为50 nmol·L-1。分别在转染后24、48和72 h取出细胞并加入CCK8试剂，检测不同时间段细胞的吸光度(A)值，表示细胞的增殖情况。以空白组作为运算基准计算细胞增殖率，细胞增殖率=(实验组A值-试剂对照组A值 ) /(空白组A值-试剂对照组A值)。

1.7 划痕实验检测划痕宽度恢复率将转染24 h后的6孔板中细胞更换无血清培养基并进行划痕实验，用高压消毒后的枪头对各组细胞划平行直线，用PBS缓冲液清洗3遍之后加入不含血清的培养基进行培养，分别于0和24 h观察细胞划痕相对宽度，采用Image Pro Plus 6.0软件计算划痕宽度。划痕宽度恢复率= (0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100%。

2 结 果

2.1 各组三阴性乳腺癌细胞中vimentin和β-catenin mRNA表达水平与空白对照组、阴性对照组和试剂对照组比较，实验组细胞中vimentin和β-catenin mRNA表达水平明显降低 (P<0.05)。 见表1。

表1 各组细胞中vimentin和β-catenin mRNA表达水平

Tab.1 Expression levels of vimentin and β-catenin mRNA in cells in various groups

表1 各组细胞中vimentin和β-catenin mRNA表达水平

GroupcontrolMDA⁃MB⁃231VimentinmRNAβ⁃cateninmRNABT⁃549VimentinmRNAβ⁃cateninmRNABlankcontrol1．000±0．1001．000±0．1001．000±0．1001．000±0．100Negativecontrol0．853±0．0600．850±0．0800．790±0．1000．822±0．080Reagentcontrol0．872±0．0800．928±0．0600．757±0．1300．808±0．110Experimental0．630±0．110∗△#0．599±0．140∗△#0．524±0．110∗△#0．466±0．130∗△#F8．66019．0719．33018．127P0．0070．0060．0050．000

*P<0.05 compared with blank control group;△P<0.05 compared with negative control group;#P<0.05 compared with reagent control group.

2.2 三阴性乳腺癌细胞中vimentin和β-catenin蛋白表达水平与空白对照组、阴性对照组和试剂对照组比较，实验组细胞中vimentin和β-catenin 蛋白表达水平明显降低 (P<0.05)。 见表2和图1。

表2 各组细胞中 vimentin和β-catenin 蛋白表达水平

Tab.2 Expression levels of vimentin and β-catenin proteins in cells in various groups

表2 各组细胞中 vimentin和β-catenin 蛋白表达水平

GroupMDA⁃MB⁃231Vimentinproteinβ⁃cateninproteinBT⁃549Vimentinproteinβ⁃cateninproteinBlankcontrol1．000±0．1001．000±0．1001．000±0．1001．000±0．100Negativecontrol0．858±0．0700．891±0．1100．918±0．1100．927±0．090Reagentcontrol0．849±0．1100．920±0．0900．986±0．0900．933±0．100Experimental0．521±0．090∗△#0．540±0．070∗△#0．698±0．130∗△#0．632±0．090∗△#F14．06313．6564．8488．448P0．0010．0020．0160．007

*P<0.05 compared with blank control group;△P<0.05 compared with negative control group；#P<0.05 compared with reagent control group.

2.3 各组三阴性乳腺癌细胞的增殖率与阴性对照组和试剂对照组比较，在48和72 h时实验组细胞增殖率明显降低(P<0.05)。见表3。

2.4 各组三阴性乳腺癌细胞迁移能力与空白对照组、阴性对照组和试剂对照组比较，实验组细胞划痕宽度恢复率明显减低(P<0.05)。见表4。

3 讨 论

EMT的发生是一个多步骤多因素的渐进过程，主要表现为E-cadherin表达缺失，导致组成细胞骨架的角蛋白转化为波形蛋白，从而启动EMT，而其调控因子和相关蛋白则成为了治疗三阴性乳腺癌的重要靶标[7-8]。

miR-200c为内源性非编码单链RNA，参与肿瘤细胞生长、增殖、凋亡、转移和侵袭，作为miR-200家族的一员，参与了乳腺癌EMT的基因调控[9]。而目前关于miR-200c调节EMT的研究大多集中在miR-200c靶向结合于E-cadherin转录抑制子(zeb1和slug)从而导致间质标志物vimentin的降低进而抑制EMT[10]。vimentin作为一类中间丝蛋白，广泛地存在于间充质细胞中，能调节黏附因子之间的相互作用导致细胞失去黏附，与细胞黏附因子E-cadherin表达相反，其表达增高常被认为是EMT的标志性改变[1,11]。本研究结果表明：miR-200c在三阴性乳腺癌细胞中可下调vimentin表达水平，与Gao等[12]在肺癌中的研究结果一致，该研究表明miR-200c可以靶向结合于ZEB1，使其不能够抑制 E-cadherin转录，导致vimentin表达降低，最终抑制EMT。

Lane 1:Experimental group; Lane 2:Negative control group; Lane 3:Reagent control group; Lane 4:Blank control group.

表3 不同时间点各组MDA-MB-231和BT-549细胞增殖率

Tab.3 Proliferation rates of MDA-MB-231 and BT-549 cells at different time points in various groups

表3 不同时间点各组MDA-MB-231和BT-549细胞增殖率

GroupMDA⁃MB⁃231(t/h)244872BT⁃549244872Negativecontrol91．86±2．0389．52±2．0490．18±2．0697．54±1．1692．31±2．0291．86±1．63Reagentcontrol94．53±1．1690．44±2．5189．70±3．1393．83±5．2291．13±2．7691．98±2．63Experimental93．67±1．5078．06±3．93∗△64．52±3．68∗△95．86±1．4286．20±2．10∗△81．22±2．91∗△F2．17316．50370．1921．2175．84919．020P0．1950．0040．0000．3710．0390．003

*P<0.05 compared with negative control group；△P<0.05 compared with reagent control group.

表4 各组DA-MB-231和BT-549 细胞划痕宽度恢复率

*P<0.05 compared with blank control group;△P<0.05 compared with negative control group；#P<0.05 compared with reagent control group.

肿瘤细胞发生EMT受到多种调控机制与信号通路的作用，诱导EMT的信号通路通常导致vimentin等关键因子的表达变化以及细胞黏附能力和骨架结构的改变。Wnt信号通路是诱导细胞发生EMT的重要信号通路，β-catenin作为Wnt信号通路的关键蛋白，也是细胞内的一种多功能蛋白，与细胞黏附因子E-cadherin形成稳点复合物维持细胞间的稳定结构。当Wnt信号通路激活之后，β-catenin大量增高并解离与E-cadherin的稳定连接，导致细胞失去彼此间的黏附从而启动EMT[3,13]。本研究结果显示：转染miR-200c的三阴性乳腺癌细胞中的β-catenin和vimentin表达水平均明显降低。β-catenin作为Wnt信号通路关键蛋白，常与EMT间质标志物vimentin和EMT转录因子slug协同变化。 研究[14-16]结果表明：slug可通过激活β-catenin启动乳腺癌EMT，同时被激活的β-catenin又上调了slug的相对表达量，在EMT的发生过程中二者起着相互促进的作用，从而建立了Wnt信号通路与EMT之间的正反馈效应。因此本文作者推测：mirR-200c可能通过下调β-catenin和vimentin，进而调节Wnt信号通路相关基因最终抑制三阴性乳腺癌EMT。

本研究对转染后细胞迁移能力和增殖能力的检测结果显示：转染miR-200c的三阴性乳腺癌细胞迁移与增殖能力均明显减弱；本研究结果进一步表明：在三阴性乳腺癌中，miR-200c可能通过降低β-catenin和vimentin的表达水平，并削弱细胞的迁移能力与增殖能力，最终抑制三阴性乳腺癌EMT。本研究将Wnt信号通路中关键蛋白β-catenin和vimentin作为miR-200c调节EMT的切入点，结合迁移能力与增殖能力实验，进一步完善了miR-200c抑制三阴性乳腺癌EMT的机制。β-catenin作为wnt信号通路与EMT之间的连接桥梁，与EMT相关因子vimentin协同表达的同时，也调节着Wnt信号的活性，其与vimentin均可被miR-200c抑制，表明miR-200c可以通过调节β-catenin活性，从而抑制三阴性乳腺癌EMT，也为寻找三阴性乳腺癌的个体化治疗方案提供了有力依据。

[1] Liu F,Gu LN,Shan BE,et al.Biomarkers for EMT and MET in breast cancer:An update[J].Oncol Lett,2016,12(6):4869-4876.

[2] HeerbothS,HousmanG,Leary M,et al.EMT and tumor metastasis[J].Clin Transl Med，2015,4(6):1-13.

[3] HowardS,DerooT,Fujita Y,et al.A positive role of cadherin in Wnt/beta-catenin signalling during epithelial-mesenchymal transition[J].PLoS One,2011,6(8):e23899.

[4] Xu J,Chen Y,Huo D,et al.β-catenin regulates c-Myc and CDKN1A expression in breast cancer cells[J].Mol Carcinog,2016,55(5):431-439.

[5] Hur K,Toiyama Y,Takahashi M,et al.MicroRNA-200 cmodulates epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in human colorectal cancer metastasis[J].Gut,2013,62(9):1315-1326.

[6] 贾莉婷,田 远,石 瑛,等.miR-200c对乳腺癌BT549细胞迁移及Slug表达的作用[J].中国免疫学杂志， 2015，31(3):304-307.

[7] 刘行仁,白义凤,梁 良,等.miR-34a通过Snail诱导肺癌EMT及促进其转移的分子机制[J].中国免疫学杂志,2017,33(5):646-651.

[8] 邓海月,于 方,姜 红.直接肾素抑制剂阿利吉仑对肾纤维化小鼠上皮-间质转化的调节作用[J].吉林大学学报：医学版,2017,43(1):16-20.

[9] Radisky DC.miR-200c at the nexus of epithelial-mesenchymal transition,resistance to apoptosis,and the breast cancer stem cell phenotype[J].Breast Cancer Res:BCR,2011,13(3):110.

[10]Lv ZD,Kong B,Liu XP,et al.miR-655 suppresses epithelial-to-mesenchymal transition by targeting Prrx1 in triple-negative breast cancer[J].J Cell Mol Med， 2016,20(5):864-873.

[11]Davis FM,Azimi I,Faville RA,et al.Induction of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in breast cancer cells is calcium signal dependent[J].Oncogene,2014,33(18):2307-2316.

[12]Gao HX,Yan L,Li C,et al.miR-200c regulates crizotinib-resistant ALK-positive lung cancer cells by reversing epithelial-mesenchymal transition via targeting ZEB1[J].Mol Med Rep,2016,14(5):4135-4143.

[13]朱智杰,阮君山,李 尧,等.Wnt信号通路诱导肿瘤细胞上皮间质转化的研究进展[J].中国药理学通报,2012,28(7):904-907.

[14]Prasad CP,Rath G,Mathur S,et al.Expression analysis of E-cadherin,Slug and GSK3beta in invasive ductal carcinoma of breast[J].BMC Cancer，2009,9:325.

[15]Stemmer V,de Craene B,Berx G,et al.Snail promotes Wnt target gene expression and interacts with beta-catenin[J].Oncogene,2008,27(37):5075-5080.

[16]许光伟,曹旭晨.β-catenin下调对乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮间质转化及侵袭迁移能力的影响[J].天津医药,2015,43(9):981-984,1093.