粗毛纤孔菌对寒凝血瘀证大鼠血液流变学的影响及谱效关系分析

李庆杰，包海鹰,2，图力古尔，李 玉

(1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心,吉林 长春 130118; 2.吉林农业大学中药材学院,吉林 长春 130118)

粗毛纤孔菌[(Inonotushispidus(Bull.:Fr.)P.Karst]为担子菌亚门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、绣革孔菌科(Hymenochaetaceae)、纤孔菌属(Ionnouts)药用真菌，目前发现其主要寄生于桑树、杨树、榆树、水曲柳、槭树和胡桃楸等树种上[1-2]。在我国新疆、吉林、黑龙江、辽宁和内蒙古等地均有分布[3]。粗毛纤孔菌被国内学者考证为桑黄[4-5]。研究[6-8]表明：粗毛纤孔菌富含多酚类物质，具有抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化和抑菌等功效。

在新疆维吾尔自治区将生长在桑树上的粗毛纤孔菌称为桑黄。古代本草记载桑黄具有活血止痛、清热解毒的功效[3]。《药性论》中记载“桑黄，性甘辛，无毒。治女子崩中带下，月闭血凝，产后血凝”，是治疗月经病的传统药材[9]，但目前，尚无相关文献报道粗毛纤孔菌具有治“女子崩中带下，月闭血凝，产后血凝”的药理作用。本文作者通过分时间段采集，得到了寄生于不同树种上的粗毛纤孔菌子实体，拟探讨生长在不同树种上的粗毛纤孔菌是否对寒凝血瘀证大鼠血液流变学产生影响，为粗毛纤孔菌是否为古代本草记载的“桑黄”提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

SPF级Wistar大鼠180只，雌雄各半，体质量220～250 g，动物使用许可证号：SCXK-(辽)2015-0001，购自辽宁长生生物技术有限公司。6种粗毛纤孔菌子实体分别采自吉林省和新疆维吾尔自治区，由吉林农业大学图力古尔教授鉴定，具体信息见表1。本文作者将6个样品命名为S1～S6：S1(黑色，寄生于水曲柳)，S2(黑色，寄生于蒙古黄榆)，S3(黄色，寄生于水曲柳)，S4(黄色，寄生于桑树)，S5(黄色，寄生于杨树)，S6(黄色，寄生于蒙古黄榆)。6份粗毛纤孔菌子实体分别用10倍量水煎煮2次，每次2 h，煎煮液浓缩，冻干，粉碎，得到提取干膏粉，作为实验用样品。阳性对照药品为复方丹参片(广东白云山和记黄埔中药有限公司，批号：20160903)。盐酸肾上腺素注射液[远大医药(中国)有限公司，批号：111102)]。

表1 粗毛纤孔菌子实体来源信息

1.2 主要仪器

血液流变测试仪(BT-300)购自北京博莱特医药技术有限公司，高效液相色谱仪(岛津 LC-20A)购自日本岛津公司。

1.3 动物分组及给药

将实验大鼠随机分为正常对照组、血瘀模型组、阳性对照组和低、高剂量粗毛纤孔菌子实体(S1～S6)组，共15组，每组12只大鼠。正常对照组和模型组大鼠给予等体积的蒸馏水。低剂量粗毛纤孔菌子实体组大鼠每日给药量相当于生药5.2 g·kg-1，高剂量粗毛纤孔菌子实体组大鼠每日给药量相当于生药7.8 g·kg-1，阳性对照组大鼠按服用说明计算给予相应剂量复方丹参片。每天给药1次，连续灌胃给药7 d。

1.4 大鼠血瘀证模型制备[10-11]

于末次给药后30 min，除正常对照组外，其他各组大鼠均经皮下注射盐酸肾上腺素注射液(1 mg·kg-1)。2 h后，将动物放入4℃冰水中浸泡5 min取出。2 h后，再次皮下注射相同剂量盐酸肾上腺素。禁食20 h后，腹腔注射20%乌来糖(5 mL·kg-1)麻醉，经腹主动脉穿刺取血3 mL，以0.1%肝素抗凝。取其中1 mL全血用血液流变仪检测全血黏度(mPa.s)；其余抗凝血液以3 000 r·min-1离心15 min，取血浆1 mL用血液流变仪检测血浆黏度(mPa.s)。

1.5 谱效关系分析实验

1.5.1 溶液配制 供试品溶液：称取粉碎过40目筛的粗毛纤孔菌子实体10 g，加甲醇超声处理4次，每次30 min，每次加甲醇10倍量，滤过，滤液合并，蒸干，再加30 mL蒸馏水溶解，用石油醚(60℃～90℃)萃取3次，每次30 mL，弃去石油醚层，水层用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定溶至5 mL容量瓶中，滤过即得。对照品溶液：称取phellibaumin A、phelligridin C(反式)、phelligridin D和3′4′-dihydroxy-5-[(11-hydroxyphenyl)-6,7-vinyl]-3,5-dioxa-fluoren-5-one自制对照品，置于10 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，配成0.2 g·L-1的对照品溶液。

1.5.2 色谱条件[12-13]流动相A(0.1%甲酸溶液)，流动相B(甲醇)，采用梯度洗脱，具体梯度洗脱程序见表2。菲罗门色谱柱(Kinetex 2.6u XB-C18 100A，美国菲罗门公司),柱温30℃,流速1.0 mL·min-1,二极管阵列检测器,检测波长400 nm,进样量10 μL。

1.5.3 谱效关系分析 对6个不同来源样品成分进行色谱分析，对每个样品中特征峰的量化峰面积和对寒凝血瘀证大鼠血液流变学的影响应用灰色系统理论建模软件(GSTAV 7.0)进行关联度分析，相关系数>0.8表明具有相关性[14-15]

表2 梯度洗脱序列时间表

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 粗毛纤孔菌子实体煎煮后出膏率

因生长环境不同，不同树种上生长的粗毛纤孔菌水提取出膏率有明显差异，其中以蒙古黄榆树为最高，杨树最低。不同采集时间样品比较，自然脱落、黑色的粗毛纤孔菌子实体出膏率均明显低于黄色子实体，表明粗毛纤孔菌的采收时间或生长环境对粗毛纤孔菌品质有较大影响。见表3。

表3 粗毛纤孔菌煎煮出膏率

2.2 各组大鼠血液流变学指标

与正常对照组比较，模型组大鼠血浆黏度和全血黏度均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，寄生于桑树、杨树、水曲柳和蒙古黄榆树的高剂量粗毛纤孔菌黄色子实体(S3～S6)组大鼠血浆黏度和全血黏度均明显降低(P<0.05)；与模型组比较，寄生于同一树种的粗毛纤孔菌黑色子实体(S1和S2)组大鼠血液流变学指标无明显变化(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血液流变学指标

Tab.4 Hemorheological indexes of rats in various groups

表4 各组大鼠血液流变学指标

GroupBloodviscosity180s-1100s-130s-13s-1Plasmaviscosity(180s-1)Normalcontrol8．32±1．279．80±1．0215．37±2．1862．90±8．90458．58±91．87Model8．63±1．61∗10．76±1．17∗17．43±2．40∗75．17±8．84∗504．10±85．06∗Positivedrug8．43±0．70△10．18±0．98△15．94±3．04△67．20±9．79△476．64±93．02△S1 Highdose8．67±0．7210．41±1．4717．87±2．4174．49±8．57497．68±85．31 Lowdose8．79±2．6410．21±3．6317．88±7．4574．45±8．53500．82±85．94S2 Highdose8．78±1．7410．52±2．2417．7±3．5574．12±9．83499．49±76．72 Lowdose8．74±1．1310．72±1．7617．93±4．0674．15±7．62496．32±68．78S3 Highdose8．51±2．42△10．33±0．50△16．54±6．66△70．40±9．89△479．44±130．24△ Lowdose8．69±1．7910．73±1．1217．22±5．3375．31±7．50491．41±91．58S4 Highdose8．49±2．58△10．47±0．46△16．87±4．59△72．43±7．72△488．46±65．91△ Lowdose8．65±2．5110．96±1．6117．15±5．3574．14±7．86500．93±85．31S5 Highdose8．46±0．68△10．31±0．78△16．69±2．07△69．21±8．51△484．09±65．03△ Lowdose8．59±0．8710．61±1．3017．46±2．7274．43±8．41502．45±72．93S6 Highdose8．50±1．91△10．39±1．14△17．09±6．14△72．78±9．61△480．26±54．90△ Lowdose8．66±1．7310．69±2．2217．85±4．6875．58±9．19503．96±61．76

*P<0. 05 compared with normal control group;△P<0. 05 compared with model group.

2.3 粗毛纤孔菌成分对寒凝血瘀证大鼠血液流变学影响的谱效关系分析

利用1.5.2中的色谱条件对6个不同来源样品(S1～S6)的成分进行色谱分析，应用灰色系统理论建模软件(GSTAV 7.0) 对其中32个特征峰的量化峰面积和对寒凝血瘀证大鼠血液流变学影响进行关联度分析，结果见表5。不同来源粗毛纤孔菌色谱峰差异情况见图1。在本研究的色谱条件下，32个特征峰为S1、S2、S3、S4、S5、S6样品共有峰，通过观察发现S1样品中的主要色谱峰集中在100～133 min，S2样品中的主要色谱峰集中在100～120 min，S3、S4、S5、S6样品中的主要色谱峰分布较分散，通过对特征峰的量化峰面积和对寒凝血瘀证大鼠血液流变学影响进行关联度分析得出，保留时间为73、75、79、81、90、94、98、100、146、161和167 min的各峰与血浆黏度变化有明显相关性，相关系数均>0.8，样品S1和S2的主要色谱峰保留时间为101、105、109、115、118、125和129 min，相关系数均<0.5，灰色系统理论建模软件中规定相关系数小于0.8被定义为不具有相关性，因此样品S1和S2中保留时间在100～120 min的主要色谱峰对活血化瘀作用所起的作用不大，而起活血化瘀作用的色谱峰分布在53～100 min和140～160 min，样品S3、S4、S5、S6中主要色谱峰均分布在这2个时间区间，经过保留时间对比，确定保留时间为73、75、79和81 min的色谱峰分别为phellibauminA、phelligridinD、phelligridinC(反式)和3′4′-dihydroxy-5-[(11-hydroxyphenyl)-6,7-vinyl]-3,5-dioxa-fluoren-5-one。

表5 各特征峰与药效的相关性

S1：Black (Parasitize in Fraxinus mandschurica Rupr);S2： Black (Parasitize in Ulmus macrocarpa var. mongolica);S3： Yellow(Parasitize in Fraxinus mandschurica Rupr);S4： Yellow(Parasitize in Morus alba L.)；S5：Yellow (Parasitize in Populus L)；S6：Yellow (Parasitize in Ulmus macrocarpa var. mongolica).

3 讨 论

“桑黄”是目前国际公认的具有良好的抗癌及提高人体免疫力活性的药用真菌，但是不同的国家、不同的地区对“桑黄”的认识有差异[16]。目前尽管有许多学者致力于“桑黄”的正本清源，但是药材品种上仍然存在混乱现象，同名异物、同物异名现象严重，与古代文献的记载不符。古代文献对“桑黄”的药效记载：“黑者，主女子漏下赤白汁，血病，症瘕积聚，腹痛，阴阳寒热无子。疗止久泄，益气不饥。其金色者，疗痹饮，积聚，腹病，金疮”。而这些疾病与现代的很多体内肿瘤或癌性胸腹水、免疫功能低下等症相当。现代研究[17-22]表明：粗毛纤孔菌有很好的抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血糖、抑菌和增强免疫作用。由此看来，“桑黄”在古书中记载功效与粗毛纤孔菌的药理作用有相同之处。为进一步证明粗毛纤孔菌即为“桑黄”，针对《药性论》中“桑黄，性甘辛，无毒，治女子崩中带下，月闭血凝，产后血凝”这一记载，本研究选择寒凝血瘀模型大鼠对粗毛纤孔菌的活血化瘀作用进行考察，结果表明：寄生于不同树种的粗毛纤孔菌黄褐色子实体具有活血化瘀的功效，与《药性论》《大观本草》中“桑黄”的功效记载相符；寄生于不同树种的散落于地面的粗毛纤孔菌黑色子实体虽然也具有一定活血化瘀功效，但未能改变寒凝血瘀模型大鼠的血液流变学指标。谱效关系研究表明:S1和S2样品的主要色谱峰保留时间为100～130 min，该区间的色谱峰所代表化学成分与粗毛纤孔菌活血化瘀活性不具有相关性；S3、S4、S5和S6主要色谱峰保留时间在53～100 min和140～160 min，该区域间的色谱峰所代表化学成分与粗毛纤孔菌活血化瘀活性密切相关。分析表明该区域色谱峰主要为酚酸类化合物，初步证明粗毛纤孔菌中具有活血化瘀作用的成分为酚酸类物质，不同树种间粗毛纤孔菌活性比较无明显差异，同一树种自然成熟仍长在树干的子实体与脱落至地面变黑的子实体间活性有明显差异，脱落至地面的子实体可能为非正常成熟脱落地面至黑或随正常成熟但脱落地面后经雨淋等因素引起其中成分变化，导致活血化瘀作用减弱。

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